詹利云，劉 璉，曾燕如，喻衛(wèi)武，戴文圣

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

榧樹Torreyagrandis是紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya中國特有的植物，呈片狀分布于浙江、福建、江西、湖南、安徽等省的丘陵地帶[1]。榧樹雌雄異株，稀同株，種內(nèi)變異十分豐富[2]。香榧T.grandis‘Merrillii’是雌性榧樹的一個(gè)優(yōu)良栽培類型，其結(jié)實(shí)所需花粉來自雄性榧樹天然居群。然而雄株因不結(jié)實(shí)而往往遭受隨意砍伐，數(shù)量大幅度減少[3]。近年來隨著香榧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到充分優(yōu)質(zhì)的授粉對(duì)雌株種實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)影響極大，日益重視在香榧豐產(chǎn)造林中配置授粉雄株的作用。因此，對(duì)榧樹雄株開展調(diào)查與選優(yōu)是提高香榧產(chǎn)量及質(zhì)量的重要因素之一。表型性狀多樣性是植物多樣性最直觀的反映，是衡量生物多樣性的重要指標(biāo)，也是了解遺傳變異的重要線索[4]。在板栗Castaneamollissima[5]、櫻桃Cerasuspseudocerasus[6]、椰棗Phoenixdactylifera[7]、李Prunusdivaricata[8]、玉米Zeamays[9]等物種中都開展了表型性狀多樣性研究。榧樹雌雄異株，天然雜交，且生長地理環(huán)境存在差異，使得天然群體內(nèi)榧樹變異十分豐富[10]。近年來對(duì)榧樹的研究主要集中在病害[11]、生物學(xué)特性[12]、栽培管理技術(shù)[13]、分子標(biāo)記[14]等方面。由于香榧具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究多集中在雌性香榧上，而雄性榧樹的研究鮮見報(bào)道。董雷鳴等[15]探討榧樹雄株若干性狀的變異發(fā)現(xiàn)：葉片與雄球花各指標(biāo)均有較大的變異系數(shù)，且不同來源的花粉對(duì)香榧幼果坐果率有顯著影響，表明榧樹雄株具有很大的選育潛力。本研究以來自5個(gè)雄性榧樹天然居群的121個(gè)單株為研究材料，對(duì)葉片、雄球花等10個(gè)表型性狀指標(biāo)進(jìn)行多樣性分析，并在此基礎(chǔ)上初選雄性榧樹優(yōu)株，為今后雄性榧樹資源保護(hù)、授粉樹配置及新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江省與安徽省是榧樹主要的天然分布區(qū)。榧樹目前主要生產(chǎn)與利用的是其種子，野生雄株天然居群除采種外受到的人為干擾較少。本研究在基本呈野生狀態(tài)的雄性榧樹天然居群開展，分布點(diǎn)分別為浙江省淳安縣半夏村(淳安)、杭州市臨安區(qū)洪嶺村(臨安)、杭州市富陽區(qū)洞橋村(富陽)、浙江嵊州市榆樹村(嵊州)及安徽省黃山市呈坎村(黃山)開展。在分布點(diǎn)的雄性榧樹林中各選取10～30株生長旺盛，彼此間距不小于50 m，無病蟲害，樹齡50～200 a的實(shí)生雄性榧樹作為研究對(duì)象，用于試驗(yàn)觀測(cè)與采樣，同時(shí)利用全球衛(wèi)星定位系統(tǒng)(GPS)定位采樣點(diǎn)(表1)。各單株采集新鮮葉片即時(shí)裝入加硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于?80 ℃冰箱保存。各單株采集20個(gè)帶雄球花的1年生幼枝，枝條底部用濕紙巾包裹后置于采樣袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行水培。

表 1 5 個(gè)雄性榧樹天然居群的地理位置及采樣數(shù) Table 1 Geographic locations of five natural populations in T.grandis

1.2 方法

1.2.1 葉片性狀測(cè)定 各單株選取20個(gè)葉片，用游標(biāo)卡尺測(cè)量(精確至0.01 mm)葉寬和葉長，并計(jì)算葉形指數(shù)(葉寬/葉長)；用托盤天平(PB1502-L，瑞士)稱取葉質(zhì)量。

1.2.2 雄球花表型性狀測(cè)定 各單株隨機(jī)選取30個(gè)雄球花，用游標(biāo)卡尺測(cè)量雄球花橫徑、縱徑，并計(jì)算花形指數(shù)(球花橫徑/縱徑)，同時(shí)用托盤天平稱取雄球花質(zhì)量。

1.2.3 雄球花水培及散粉時(shí)間觀察 各單株選取3個(gè)雄球花數(shù)量較多且長勢(shì)良好的枝條插入水中，置于浙江農(nóng)林大學(xué)校園，培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度20 ℃，濕度75%，光強(qiáng)400 μmol·m?2·s?1，二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)520 μmol·mol?1，2 d更換1次水，每天定期觀察并記錄花枝散粉情況。當(dāng)雄球花的小孢子葉松散，顏色變黃，花粉囊縱裂，部分花苞散出黃色花粉時(shí)記為始花期，直至完全散粉。大約3 d時(shí)間。

1.2.4 花粉得率測(cè)定 每個(gè)單株各選30個(gè)即將散粉(即各小孢子葉松散，花苞顏色變黃，花粉囊開始縱裂)的雄球花，置干燥玻璃培養(yǎng)皿中，放置在室內(nèi)干燥桌面上，使雄球花自然散粉。待雄球花完全開放，抖落所有花粉，收集花粉稱量，計(jì)算花粉得率。花粉得率=[花粉質(zhì)量/(花粉質(zhì)量+撒粉后球花質(zhì)量)]×100%。

1.2.5 花粉生活力測(cè)定 在全程避光的條件下，用熒光染料反應(yīng)法(fluorescein diaectate reaction，二乙酸熒光素染色)測(cè)定花粉生活力[16]。隨機(jī)觀測(cè)3個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)有活力花粉(呈綠色)數(shù)量和花粉總數(shù)(綠色和黑色)?；ǚ凵盍?(有活力花粉數(shù)量/花粉總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel和SPSS 17.0對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析、t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性榧樹葉片與雄球花表型性狀的差異顯著性分析

方差分析表明：葉片性狀的葉長在居群間有顯著差異(P＜0.05)，雄球花性狀的花粉得率在居群間呈極顯著性差異(P＜0.01)，其他指標(biāo)均無顯著差異(表2)。t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示：在居群內(nèi)單株間10個(gè)表型性狀均差異極顯著(P＜0.01)，表明雄性榧樹表型性狀的變異可能主要來源于居群內(nèi)。

表 2 雄性榧樹5個(gè)居群葉片與雄球花相關(guān)指標(biāo)的方差分析Table 2 ANOVA in leaf-and male flower-associated parameters among five natural populations in T.grandis

多重比較分析發(fā)現(xiàn)：葉長在5個(gè)居群間差異顯著(P＜0.05)，5個(gè)居群中淳安居群的葉片平均最長(18.99 mm)，顯著長于其他居群；嵊州與黃山居群的葉片最短，且2個(gè)居群間無顯著差異；臨安與富陽居群的葉片長度居中，2個(gè)居群間無顯著差異(圖1A)。花粉得率在5個(gè)居群間差異極顯著(P＜0.01)，嵊州和富陽居群的花粉得率較高，顯著高于其他居群，且2個(gè)居群間無顯著差異；而淳安與臨安居群花粉得率最低且無顯著差異(圖1B)。

圖 1 雄性榧樹5個(gè)居群葉長(A)和花粉得率(B)的變化Figure 1 Varieties among five natural populations in the leaf length(A) and pollen yield(B) in T.grandis

變異系數(shù)與性狀的離散程度呈正相關(guān)，變異系數(shù)越大表明個(gè)體間的差異越大，多樣性越豐富，選擇的潛力就越大[17]。本研究表明：同一性狀在不同居群中變異系數(shù)不同；同一居群中不同性狀的變異系數(shù)也存在差異。5個(gè)雄性榧樹居群間葉片的變異程度由大到小依次為葉質(zhì)量、葉長、葉形指數(shù)、葉寬；雄球花的變異程度由大到小依次為花粉生活力、花粉得率、球花質(zhì)量、球花縱徑、球花橫徑、花形指數(shù)。花粉生活力的變異最為豐富，5個(gè)居群的花粉生活力為51.70%～58.51%，變異系數(shù)為39.04%～45.40%，平均值為42.36%；其次是花粉得率(31.03%～37.77%)，平均達(dá)34.13%；葉寬和球花橫徑變異系數(shù)較小，分別為10.82%和12.13%(表3)。

表 3 5個(gè)雄性榧樹居群葉片與雄球花指標(biāo)的極值與變異Table 3 Extreme values and variation in the parameters of leaves and male flowers of five natural populations in T.grandis

居群差異體現(xiàn)了居群對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的不同適應(yīng)狀況，數(shù)值大小反映了不同居群對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性[18]?；谌~片的表型指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)：5個(gè)天然居群的變異系數(shù)臨安(16.27%)最大，其次是嵊州(14.73%)，淳安(10.74%)最?。欢矍蚧ㄊ轻又?26.82%)和黃山(26.42%)的變異系數(shù)較高，淳安(19.49%)最小。本研究中榧樹雄株的生殖器官花的變異系數(shù)大于營養(yǎng)器官葉。

2.2 雄球花散粉時(shí)間的變異

榧樹雄株的散粉時(shí)間不僅與遺傳有關(guān)[15]，也與地域氣候、環(huán)境差異有關(guān)。榧樹的雌雄花期不集中，且雄株花期比雌株早[19]，散粉時(shí)間一般在4月中旬[20]。因此在新造林中要配置適當(dāng)花期的雄性授粉樹，滿足雌花充分受粉的要求[15]。

經(jīng)溫室水培雄球花枝觀測(cè)統(tǒng)計(jì)，雄球花散粉時(shí)間在4月7?17日，散粉周期約10 d。中花型所占比例最大(47株)，占總樣本數(shù)的38.84%，散粉時(shí)間在4月11?15日；晚花型比例最小(30株，24.79%)，散粉時(shí)間在4月15?17日(表4)。5個(gè)居群中，淳安、臨安、黃山這3個(gè)居群的中花型偏多，分別有11、13、13株，而富陽和嵊州的早花型略多，花期為4月7?11日(表4)。

表 4 5 個(gè)天然居群榧樹雄株散粉期比較Table 4 Pollen availability of male flowers in T.grandis

2.3 雄性榧樹葉片表型性狀間的相關(guān)性分析

葉質(zhì)量、葉長與葉形指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，而其他指標(biāo)間均為顯著正相關(guān)(P＜0.05)(表5)。這與董雷鳴等[15]的研究結(jié)果一致。

球花質(zhì)量與球花大小及花粉得率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，球花大小與花粉得率均顯著正相關(guān)(P＜0.05)，花粉活力與花粉得率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，而球花質(zhì)量和球花縱徑都與花形指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，其他指標(biāo)間相關(guān)性不顯著 (表 6)。

表 5 雄性榧樹葉片各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficients among indexes of leaves in male T.grandis

表 6 榧樹雄球花及各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients among indexes of male flowers in T.grandis

2.4 雄性榧樹優(yōu)株的初選

花粉會(huì)對(duì)植株坐果率高低、果實(shí)大小以及產(chǎn)量等產(chǎn)生直接影響[21?22]。篩選適宜的雄性優(yōu)株可以提供香榧基地授粉雄株不足、香榧樹體坐果率低的現(xiàn)狀，從而促進(jìn)香榧產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。營養(yǎng)器官葉片受環(huán)境影響較大，因而榧樹可基于生殖器官的性狀初選核心種質(zhì)[23]。本研究主要依據(jù)榧樹雄株散粉時(shí)間、花粉生活力、花粉量的多少等綜合進(jìn)行雄株優(yōu)株的篩選。早花類型中表現(xiàn)較好的優(yōu)株有富陽居群的雄9、嵊州居群的雄5以及黃山居群的雄23，花粉生活力分別高達(dá)92.55%、92.08%、90.01%，花粉得率也在20%以上；中花類型表現(xiàn)最佳的優(yōu)株有臨安居群的雄22、嵊州居群的雄1，花粉活力均在90%以上，花粉得率也不低；而晚花類型中，淳安居群的雄3、臨安居群的雄18以及黃山居群的雄1花粉生活力分別為92.71%、92.61%、91.65%，共初選36個(gè)單株作為優(yōu)良授粉樹，占所有供試材料的29.75%(表7)。

表 7 雄性榧樹優(yōu)株的初選Table 7 Screening of male elite trees in T.grandis

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)：在居群間，葉片與雄球花的10個(gè)表型指標(biāo)，只有葉長和花粉得率差異顯著，而居群內(nèi)，單株間10個(gè)指標(biāo)均差異極顯著，表明居群內(nèi)的變異比居群間更加豐富。該結(jié)果與劉浩凱等[24]研究雌性榧樹居群遺傳多樣性的結(jié)果基本一致。因此，為配置香榧授粉樹的榧樹雄株選育可選擇優(yōu)良單株。

變異系數(shù)是衡量各觀測(cè)性狀變異程度的一個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。本研究各指標(biāo)的相對(duì)極差和變異系數(shù)的變化趨勢(shì)完全不同，表明榧樹雄株表型性狀存在豐富的表型多樣性。經(jīng)過長期的自然選擇，不同數(shù)量性狀對(duì)環(huán)境形成了不同的適應(yīng)能力。相關(guān)分析表明：雄性榧樹的大部分表型性狀相關(guān)性達(dá)顯著或極顯著水平，說明這些性狀在環(huán)境適應(yīng)中表現(xiàn)出相互調(diào)節(jié)的作用。

雄性榧株以提供花粉為主要利用目的，花粉得率和花粉生活力在居群間和個(gè)體間變異大，且比較穩(wěn)定，不僅有利于選擇，選擇結(jié)果也相對(duì)可靠。本研究顯示：雄球花各指標(biāo)變異系數(shù)大，球花大小與花粉得率呈顯著正相關(guān)，直接影響花粉得率。因此優(yōu)株初選應(yīng)從花粉生活力、花粉得率及球花大小等綜合考慮?；谏鲜鲋笜?biāo)初步篩選出36個(gè)優(yōu)良雄性單株，其中8個(gè)單株的花粉生活力在90%以上。在今后的育種工作中，這些雄性優(yōu)株應(yīng)是優(yōu)先考慮的對(duì)象。本研究所有單株的花粉得率最高值為38.23%，與董雷鳴等[15]的研究結(jié)果類似。

居群內(nèi)的變異主要受遺傳因素的影響，而居群間的變異則與遺傳和環(huán)境2個(gè)因素相關(guān)[25]。由于榧樹雄株不結(jié)果，以往人為破壞嚴(yán)重，部分地區(qū)的雄株資源已瀕臨絕跡，雌雄比例嚴(yán)重失調(diào)。易官美等[26]對(duì)榧樹資源分布進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)：雌雄株比例在江西巖泉自然保護(hù)區(qū)為4∶1，在福建建甌玉山鎮(zhèn)居群為29∶1；在安徽居群為19∶1；在浙江諸暨趙家鎮(zhèn)居群為99∶1。因此，加強(qiáng)雄性榧樹資源保護(hù)刻不容緩，需加大種質(zhì)資源調(diào)查與收集力度，建立雄性榧樹優(yōu)株資源庫。

本研究僅對(duì)雄性榧樹的表型多樣性進(jìn)行初步研究，后續(xù)的研究將擴(kuò)大居群選擇的范圍及居群個(gè)數(shù)，并結(jié)合分子生物學(xué)從DNA水平深入揭示雄性榧樹天然居群的遺傳變異特點(diǎn)和規(guī)律。