周 潛, 尹躍平

(1. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院, 江蘇 南京, 210042;2. 中國疾病預防控制中心性病控制中心, 江蘇 南京, 210042)

人乳頭瘤病毒(HPV)屬于乳多空病毒科中的乳頭瘤病毒屬，為球形無包膜的雙鏈DNA病毒，HPV感染具有高度的種屬特異性，人類是其唯一宿主[1]。HPV具有200多種類型，不同HPV類型具有感染不同身體部位的傾向[2]，從而引起不同疾病。HPV 6型和11型常感染肛門生殖器引起良性生殖器疣[3]，HPV 16型感染口腔和咽喉黏膜可引起口咽部潛在惡性疾病與鱗狀細胞癌等多種不良后果。HPV 16型和18型與陰道、宮頸、肛門或陰莖的鱗狀上皮內(nèi)病變或癌有關[4-5]。對于HPV在不同部位的感染，采用相應的檢測方法對相關疾病的早期診斷與治療具有重大意義。本文綜述了口咽部HPV感染引起的不良后果和口咽部HPV感染檢測方法的研究進展，并對不同方法的原理與性能進行了對比。

1 口咽部HPV感染的不良后果

1.1 口腔潛在惡性疾病(OPMD)

OPMD的概念于2005年由WHO提出，旨在定義具有轉(zhuǎn)化為口腔鱗狀細胞癌潛力的口腔表現(xiàn)，包括白斑、黏膜下纖維性變和扁平苔蘚等[6-7], 其中以口腔白斑最為常見，全球患病率為1%～3%[7]。HPV感染是OPMD的危險因素之一, HPV感染與口腔扁平苔蘚和口腔白斑顯著相關[8], 常為HPV 16型或18型感染。薈萃分析[9]表明，白斑合并HPV患病率為20.2%, 扁平苔蘚為23.0%, 口腔黏膜下纖維化為28.6%。高危HPV在OPMD的惡性轉(zhuǎn)化中起到重要作用, HPV E6和E7蛋白可以調(diào)節(jié)包括p53功能喪失、抗凋亡功能增強和端粒酶活性增加等多種細胞變化[10]。

1.2 頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)

HNSCC主要指起源于口腔、鼻腔、咽喉部位的鱗狀細胞癌，是全世界發(fā)病率第六的惡性腫瘤, 2018年全球共有89萬新發(fā)病例, 45萬死亡病例[11-12]。根據(jù)是否存在HPV感染可分為HPV陽性HNSCC和HPV陰性HNSCC, 其中HPV陽性HNSCC患者具有更好的預后[13-14]。根據(jù)2016年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全世界口咽部鱗狀細胞癌(OPSCC)中HPV陽性率為20.6%, 喉癌中為23.6%, 鼻竇癌中為29.6%, 鼻咽癌中為31.1%[15], 以HPV-16型和HPV-18型等高危HPV感染為主[16]。其中男性HPV陽性HNSCC患病率是女性的3～6倍，其原因可能為男男性行為導致的肛門生殖器和口咽部HPV持續(xù)感染[17]。

感染HPV是HPV陽性HNSCC的早期事件，經(jīng)口性行為是引起口咽部HPV感染的主要因素, HPV病毒可通過破損的口腔上皮或扁桃體隱窩進入口腔上皮基底層[18]。在HPV陽性HNSCC的發(fā)展過程中，HPV病毒基因組能穩(wěn)定整合到宿主干細胞或增生的基底細胞基因中。在宿主細胞的致癌轉(zhuǎn)化中, HPV E6和E7蛋白起主要作用, E6蛋白與腫瘤抑制因子p53形成復合物，促進p53的泛素化和蛋白酶體降解[19]。E7蛋白與視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1(RB1)緊密結合，促進蛋白酶體降解RB1，導致E2F家族的轉(zhuǎn)錄因子釋放[20], 使細胞進入S期，驅(qū)動細胞周期進展，促進細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞[21]。

2 口咽部HPV檢測方法

目前，已經(jīng)開發(fā)出多種檢測口咽部病變中HPV的方法，包括核酸檢測法(HPV DNA檢測和E6/E7 mRNA檢測)、免疫組化(IHC)、原位雜交法(ISH)和血清學等方法。

2.1 核酸檢測法

2.1.1 HPV DNA 聚合酶鏈式反應(PCR)檢測HPV DNA是一種具有高靈敏度且較為簡便廉價的技術，常使用通用引物如PGMY09/PGMY1和GP5+/GP6+靶向擴增HPV DNA保守序列(L1基因)，擴增后使用凝膠電泳、限制性片段長度多態(tài)性或直接測序的方法鑒定HPV基因型。薈萃分析[22]表明, PCR法的靈敏度和特異性分別為94%～100%和74%～92%。PCR法適用于各類標本，但由于其高靈敏度，標本制備或采樣過程中的交叉污染容易導致假陽性[23]。同時，由于HPV的一過性感染不足以發(fā)展為癌，僅進行HPV DNA檢測并不能提供病毒轉(zhuǎn)錄的信息，難以證明HPV的病毒感染活性，因此HPV DNA檢測常與其他方法結合能夠提高靈敏度。

2.1.2 E6/E7 mRNA檢測 HPV的持續(xù)感染并驅(qū)動細胞的惡性轉(zhuǎn)化基于E6和E7蛋白的表達，因此檢測E6或E7蛋白的表達可確定樣品是否為HPV驅(qū)動的腫瘤。采用逆轉(zhuǎn)錄(RT)與實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)方法對E6/E7 mRNA進行擴增和鑒定是目前鑒定HPV陽性HNSCC的金標準[24], 但由于mRNA在環(huán)境中容易降解，該方法對標本要求較高，需新鮮或冰凍的組織樣品[25]。由于進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)技術要求較為復雜、成本較高等原因，現(xiàn)難以用于對HPV陽性頭頸部鱗狀細胞癌的常規(guī)篩查。

2.2 免疫組化法

目前已有研究[26-28]將p16 蛋白免疫組化(IHC)作為診斷HPV感染的替代指標。美國病理學家學院以及美國臨床腫瘤學會指南[29-30]也建議使用p16 IHC對HNSCC的腫瘤樣本進行HPV檢測。當HPV感染鱗狀上皮細胞時, HPV E7基因表達，使CDK4抑制因子Rb失活，破壞其與轉(zhuǎn)錄因子E2F結合的能力，引起細胞增殖失調(diào)。異常增殖的細胞中，CDK4抑制劑p16蛋白過度表達，因此可將p16上調(diào)作為HPV感染的替代指標[31]。相關分析[32-35]表明, p16蛋白表達在診斷口咽鱗狀細胞癌中的HPV感染時敏感度為80%～90%，特異度約為80%～90%。由于其檢測成本較其他方法低2～6倍[36], 并可用于福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織樣品, p16 IHC在進行HPV陽性HNSCC的大規(guī)模篩查中較為適用。PRIGGE E S等[22]研究表明, IHC-p16與HPV-DNA結合檢測能顯著提高診斷HPV的特異度，這種檢測新策略更適合于需要降級治療的患者。

2.3 原位雜交法

2.3.1 靶向DNA的原位雜交(DNA ISH)DNA ISH技術將特定標記的探針與組織切片中的DNA雜交，可直接觀察組織切片中細胞內(nèi)的靶向DNA, 根據(jù)常規(guī)光學顯微鏡可判讀陽性結果并準確反映HPV的存在。目前已開發(fā)出多種商業(yè)DNA ISH檢測試劑盒，包括Enzo、Ventana 和TellgenplexTMHPV DNA試劑盒，可識別HPV 16、18型等多種HPV亞型[37-38]。但HPV DNA ISH技術多用于對宮頸癌HPV檢測中，在頭頸部鱗狀細胞癌中由于背景信號阻礙DNA標記信號的識別，易導致假陰性的產(chǎn)生。研究[39]表明，當腫瘤細胞中HPV拷貝數(shù)小于100時25%～45%的病例被報告為假陰性。

2.3.2 靶向RNA的原位雜交(RNA ISH)由于DNA ISH技術假陰性率高的原因，更多研究[33-34, 40]傾向于使用RNA ISH法來檢測HNSCC中的HPV。以RNA RT-qPCR作為金標準, HPV ISH的靈敏度為87%～100%, 特異度為88%～100%, 具有較高的檢測性能。RNA ISH技術靈敏度和特異度主要取決于探針的選擇，其中RNAscope技術適用小體積探針，可與部分降解的mRNA雜交，具有在石蠟包埋的組織樣品中進行檢測的優(yōu)勢，可同時對高風險HPV與HPV活動性感染提供依據(jù)。但由于該方法成本較高，目前僅用于科學研究，尚未被推薦用于臨床常規(guī)使用[41]。

2.4 血清學方法

在口咽部HPV的血清學檢測中，基于HPV 16型的生物標志物研究最多, HPV16 E6抗體已被確定為HPV相關口腔癌的早期生物標志物，可通過Luminex和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等方法對血清中的抗體進行檢測[42]。LANG KUHS K A等[43]研究表明, HPV16 E6抗體在HPV相關口腔癌的診斷中靈敏度為90%, 特異度為96%。除E6抗體以外，針對HPV16 L1抗體的快速檢測方法Prevocheck?也表現(xiàn)出較好的靈敏度和特異度[44]。但由于缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù), E6抗體檢測的方法還未應用于常規(guī)臨床檢測。有研究[45]評估了葉酸、胰島素樣生長因子(IGF)-1、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)-3和干擾素-γ(IFN-γ)水平作為HPV相關腫瘤的候選標志物，但總體有效性較差，相比直接檢測HPV抗體特異性較低。

2.5 方法比較

在多種口咽部HPV感染的檢測方法中, p16蛋白免疫組化染色法是目前成本最低的技術，適合于對HPV陽性HNSCC患者的早期篩查，但該方法也存在一定的誤診率和漏診率，需結合其他方法結果進行確診。2種原位雜交方法中, RNA ISH體現(xiàn)出了較高的檢測性能，但由于成本較高，臨床常規(guī)使用難以普及; DNA ISH可能出現(xiàn)由于技術原因難以判讀結果所帶來的假陰性，導致漏診率較高，也較少用于臨床。E6/E7 mRNA檢測是目前鑒定HPV陽性HNSCC的金標準，但要求新鮮或者冷凍的組織樣本，對于臨床更常見的FFPE樣本，常使用DNA PCR的檢測方法。綜上，對于口咽部HPV感染的檢測，可在前期使用p16免疫組化染色法，當觀察到染色陽性時，再使用從FFPE樣品中提取的DNA使用PCR法進行確認。該策略在荷蘭與英國的研究[24, 46]中獲得了驗證，靈敏度和特異度可達到100%，但此方法耗時較長，可能延長日常臨床工作中的診斷時間。

3 展 望

HNSCC是全球常見的惡性腫瘤之一，口咽部HPV感染是其主要病因，對患有OPMD等口腔特征表現(xiàn)的重點人群進行口咽HPV感染的篩查具有一定的必要性，早期檢測高危HPV可更準確地診斷癌前病變和早期癌。在檢測方面，目前核酸擴增法與IHC是主要的HPV抗原檢測手段，同時也存在多種替代方法協(xié)助診斷患者是否存在HPV感染，可根據(jù)地區(qū)特點與實驗室條件選用適宜的檢測方法。隨著各種新型檢測技術的不斷進步，有望在未來研究出具有高靈敏度和特異度，且成本控制較低的單步法檢測技術應用于口咽部HPV的檢測中。