金實，肖鋒，胡曉雪，段雪云，熊義濤，王金波，李成銀，孫婉瑾

(1.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北武漢 430074)

中醫(yī)內病外治法應用歷史悠久，早在《黃帝內經》和《傷寒雜病論》中就有相關記載[1]。清代吳師機《理瀹駢文》闡述了經絡的作用，認為外治法是通過體表經絡到達體內而發(fā)揮治療作用。依據十二經脈循行走向，手太陰肺經循行由肺至手，因此可通過浸手法從肺論治咳喘[2]；足太陰脾經循行由足至脾，而脾為生痰之源，故咳喘合并痰多的可通過泡足法由脾論治[3]。小兒臟腑嬌弱、肺衛(wèi)不固，外感寒邪易侵入肺衛(wèi)，肺失宣降而發(fā)咳嗽；另外，小兒脾常不足、脾虛不運，阻遏肺氣，肺氣上逆而積濕生痰?；谝陨仙聿±硖攸c，小兒哮喘、肺炎、支氣管炎等常有咳喘含痰之癥[4]。但是小兒應用口服藥和注射劑等治療順應性差，副作用大[5-6]，因此，應用中藥進行浸手浴足是治療小兒咳喘的佳選，且小兒皮膚薄嫩，透皮吸收效果更佳。

咳喘浸手浴足Ⅰ號是我院兒科劉曉鷹教授經驗方，在臨床應用數年，深受患者好評。其處方由麻黃、細辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草組成，藥材粗粉加適量沸水進行熏蒸，水溫合適后浸手浴足。麻黃、細辛、桂枝、吳茱萸、鵝不食草等均含有豐富的揮發(fā)性成分[7-11]，有報道證明麻黃、細辛、吳茱萸和鵝不食草揮發(fā)油均具有平喘功效[12-15]。并且越來越多的研究表明中藥揮發(fā)性成分中的單萜和倍半萜類天然化合物具有促進透皮吸收的作用，其特點為起效快、促滲作用強、不良反應少等[16-19]，主要促滲機制為擾亂皮膚角質層的高度有序排列、“拉動效應”及增強皮膚角質層的水合作用等[20]。

本研究采用頂空-氣相色譜-質譜(HS-GC-MS)聯用方法進行咳喘浸手浴足Ⅰ號揮發(fā)性成分分析，確立共有特征峰，并進行指認。對其中可能存在的活性成分和促進透皮吸收的成分進行定性分析，為該制劑的后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司)，包含7697A型頂空進樣器、G4513A型自動進樣器、Agilent DB-5MS毛細管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)、Agilent Masshunter Qualitative Analysis定性工作站、NIST17型質譜數據庫；真空機械泵(德國Pfeiffer Vacuum公司)；ES2252SM-DR十萬分之一天平(瑞士Precisa公司)；高純氦氣(純度≥99.999%，武漢華星工業(yè)技術有限公司)。

1.2 試藥

麻黃、細辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草，經湖北省中醫(yī)院主任藥師段雪云鑒定，符合《中國藥典》2015版一部要求。處方量五味藥材混合后40目粗粉制備咳喘浸手浴足Ⅰ號，本實驗所用10批供試品[S1～S10，批號分別為20190501(分裝)、20190501、20190102、20181201、20181001、20180701、20180518、20180501、20180323、20180110]均由湖北省中醫(yī)院制劑中心生產。

2 方法與結果

2.1 揮發(fā)性成分的提取

咳喘浸手浴足Ⅰ號在臨床使用的方法是藥材混合粗粉加適量沸水(100 ℃)持續(xù)加熱進行熏蒸，停止加熱待水溫合適后浸手浴足。參考應用HS-GC-MS技術對麻黃、細辛和吳茱萸進行成分分析的文獻[8，10，21]，并在一定的溫度范圍內進行預實驗，確認頂空提取揮發(fā)性成分的方法條件。

精密稱取各批次咳喘浸手浴足Ⅰ號供試品0.5 g，置于10 mL頂空進樣瓶中，封口密閉，依次置頂空進樣器中按以下條件進樣：樣品瓶加熱溫度100 ℃，定量環(huán)溫度105 ℃，傳輸線溫度110 ℃，加熱40 min，提取咳喘浸手浴足Ⅰ號易揮發(fā)性成分進行分析。

2.2 氣相色譜及質譜條件

色譜條件：載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)，載氣流量 1.0 mL/min；分流比100︰1，進樣口溫度200 ℃，進樣量1 μL；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，以 4 ℃/min 升至120 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至 160 ℃，保持5 min。

質譜條件：電離方式EI，轟擊電壓70 eV，正離子模式，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，數據采集模式為全掃描[22]。

2.3 化學成分分析

按實驗設計條件測定各批咳喘足浴方揮發(fā)性成分，提取電元文件，進行比對，建立咳喘浸手浴足Ⅰ號揮發(fā)性成分共有圖譜(見圖1)，得到17個共有峰，譜庫檢索結合文獻進行識別，共識別出17種成分，保留時間、化學名稱、分子式和相對總成分的百分含量等相應信息見表1。識別出3號峰為1R-(+)- α-蒎烯，5號峰為β-蒎烯，6號峰為月桂烯，7號峰為3-蒈烯，8號峰為D-檸檬烯，12號峰為2,3,5,6-四甲基吡嗪，以上幾種成分為處方藥材揮發(fā)油中主要成分，來源明確，歸屬可靠，并且在氣相色譜圖中分離較好。

圖1 咳喘浸手浴足Ⅰ號揮發(fā)性成分總離子共有圖譜

表1 咳喘浸手浴足Ⅰ號揮發(fā)性成分分析

3 討論

咳喘浸手浴足Ⅰ號是我院兒科劉曉鷹教授經驗方，辨證與辨病相結合，針對小兒咳喘的主要發(fā)病機制，反復甄選藥味組方而成，全方辛溫宣肺、降逆化痰，適用于風寒犯肺、風寒閉肺及寒性哮喘。麻黃、細辛、桂枝和鵝不食草均屬于辛溫解表、發(fā)散風寒之藥，其中麻黃宣肺平喘，細辛溫肺化飲，桂枝平沖降氣，鵝不食草則通鼻竅、止咳；吳茱萸屬辛熱溫里藥，可散寒止痛，降逆止嘔[23]。方中5味藥材皆味辛，與所含豐富的揮發(fā)性成分密切相關[24]。麻黃、細辛、桂枝、吳茱萸、鵝不食草等均含有豐富的揮發(fā)性成分[7-11]，具有平喘相關功效[12-15]。

本研究采用HS-GC-MS技術對咳喘浸手浴足Ⅰ號進行揮發(fā)性成分分析，結合臨床實際使用該制劑的方法，參考相關文獻報道[8，10，21]確立樣品瓶加熱溫度為100 ℃；根據HS-GC-MS設備的技術要求，傳輸線溫度要適當高于定量環(huán)溫度，定量環(huán)溫度要適當高于樣品加熱瓶溫度，確立定量環(huán)溫度105 ℃，傳輸線溫度110 ℃。如果條件溫度過低不符合實際應用情況，溫度過高會影響結果重現性。通過頂空進樣提取揮發(fā)性成分后進行GC-MS分析，建立該制劑的揮發(fā)性成分HS-GC-MS圖譜，找到17個共有成分，進行識別，充分反映出揮發(fā)性成分的組成情況。

本研究識別出的17個共有化合物均有相關文獻支持來自麻黃、細辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草，結合譜庫檢索進行匹配，可以識別為表2列出的相應化合物。早在1983年，孫靜蕓[25]就從麻黃平喘有效部位分離出了兩個具有平喘作用的單體，本研究中的No.12化合物2,3,5,6-四甲基吡嗪即是其中之一。2,3,5,6-四甲基吡嗪(川芎嗪)應用于小兒哮喘的臨床研究報道也越來越多[26-28]，可能作用機制為：擴張哮喘患者支氣管[29-30]；明顯抑制慢性和非特異性炎癥[31]；促進內皮細胞釋放內皮依賴性血管舒張因子而發(fā)揮擴血管作用，從而改善哮喘患者的肺動脈高壓[32]；減少哮喘患者的血小板激活因子和血栓素A2水平[33]。

咳喘浸手浴足Ⅰ號中麻黃、桂枝和細辛均含有D-檸檬烯，故而復方含量高達16.26%。D-檸檬烯是一種中草藥揮發(fā)油類的透皮吸收劑，不但可以促進川芎嗪的透皮吸收[34]，而且本身也是一種具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌作用的有效成分；細辛和吳茱萸中含有的α-蒎烯同樣具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗真菌和促進透皮吸收作用。檸檬烯、α-蒎烯和桉油精能協(xié)同起效，用于抗炎、擴張支氣管和促使痰液排出，是桉檸蒎腸溶軟膠囊的有效成分，口服吸收良好，但其自身的透皮吸收程度還有待驗證[35-38]。另外，本研究檢測出的月桂烯(No.6)、蒎烯(No.3和No.5)、蒈烯(No.7)等萜類化合物均為天然的經皮給藥制劑的促滲劑[20]。

咳喘浸手浴足Ⅰ號中含有的揮發(fā)性成份無論是藥理作用還是促進透皮吸收作用均與處方用于小兒咳喘治療相吻合。本研究僅針對本實驗條件下的揮發(fā)性成分進行分析，不排除處方中非揮發(fā)性成分通過透皮吸收進入體內起效，有待進一步研究。川芎嗪為該方可能主要有效成分，但作為注射或者是口服劑型在小兒用藥上都有順應性差和副作用大的劣勢，而咳喘浸手浴足Ⅰ號作為外用制劑不僅克服了這些缺點，還有透皮吸收給藥方式避免首過效應的優(yōu)點，為小兒咳喘治療提供了新的治療方式。