顏飛翔 朱 丹 苗欣月 牛廣財 魏文毅 朱立斌

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院3，大慶 163319)

糜子(PanicummiliaceumL.)又叫稷、黍和糜，屬禾本科黍?qū)伲旮?0-100 cm，生長期短，喜溫，耐旱[1]。在我國東北、西北和華北等地均有栽培。糜子的營養(yǎng)價值很高，有“五谷之王”的美譽(yù)。糜子果實為穎果，磨米去除皮殼后稱黃米，而糜子麩皮作為糜子加工的副產(chǎn)品，約占糜子質(zhì)量的20%，但其開發(fā)利用程度低，除部分用作釀醋原料或飼料外，大部分被廢棄[2]。糜子麩皮中含有豐富的多酚類物質(zhì)。植物多酚是由植物次生代謝產(chǎn)生的一類酚羥基化合物，在豆類、蔬菜、水果和谷類植物的葉、皮、根和果實中廣泛存在，被喻為“第七大營養(yǎng)物質(zhì)”[3,4]。研究表明，植物多酚除了抗氧化作用之外，其本身多樣的結(jié)構(gòu)也使其具有其他的生物活性，如防治老年癡呆[5，6]、抗炎[7]、抑菌[8]、抗腫瘤[9，10]、調(diào)節(jié)腸道菌群[11]及心血管疾病[12]等功效，且已被廣泛應(yīng)用于藥品及保健品等領(lǐng)域[13]。

目前，提取植物多酚的方法有很多種，例如溶劑浸提法、超聲輔助提取、酶解提取法、微波輔助提取、超臨界CO2萃取法等等[14-16]。其中，關(guān)于糜子皮殼中提取多酚已有一些報道。楊聯(lián)芝等[17]采用冰浴均質(zhì)輔助提取糜子殼中多酚的最佳工藝條件為：丙酮濃度90%，料液比1∶30，提取5次，多酚得率為1.458%；牛偉等[18]研究了糜子皮多酚的水酶法提取工藝，當(dāng)乙醇溶液pH 4.15，固液比1∶42.5，加酶量1.00%，酶解時間4 h，提取3次時，糜子麩皮酚酸提取率可達(dá)1.94 mg/g；王振等[2]通過超聲輔助法提取糜子皮中多酚，得到的最佳條件為：40%乙醇為提取劑，料液比1∶25，超聲功率320 W，在室溫下提取40 min，糜子皮中多酚的平均提取率為9.9mg/g；臧盛等[19]則采用冰浴乳化法和堿化消化后有機(jī)溶劑萃取法，對15種糜子殼粉中多酚類物質(zhì)的含量、組成及抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在15個糜子樣品中殼粉中多酚含量為9.357 3～19.092 9 mg/g，主要以結(jié)合酚的形式存在，糜子殼粉中不同存在形式的多酚物質(zhì)均具有抗氧化活性。

超聲波-微波協(xié)同萃取作為一種新技術(shù)，解決了單獨(dú)超聲波和微波提取的不足，超聲波產(chǎn)生的振蕩能彌補(bǔ)微波傳熱不均的缺陷，而微波的熱能有效地彌補(bǔ)超聲波產(chǎn)熱不足的問題[20]。目前，鮮有超聲波-微波協(xié)同萃取方法在糜子麩皮多酚提取中的應(yīng)用。因此，本研究采取超聲波-微波協(xié)同萃取方法，以多酚提取量為考察指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件，并測定其抗氧化活性，以期為糜子皮殼資源高附加值產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜子麩皮，黑龍江省肇源縣產(chǎn)龍黍23品種，礱米后的副產(chǎn)物；福林酚試劑、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)；無水乙醇、無水碳酸鈉、維生素C等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GY-FS-02多功能高速粉碎機(jī)，XH-300A型電腦微波超聲波合成/萃取儀，L420臺式低速離心機(jī)，UV-1100紫外可見分光光度計，RE 3000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-D(Ⅲ)真空泵。

1.3 方法

1.3.1 單因素實驗設(shè)計

考察液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲波功率、提取時間、微波功率各自對糜子麩皮多酚提取量的影響[21]。選取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1[16,21]，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%[22]，提取溫度45、55、65、75、85 ℃[22]，超聲波功率400、600、800、1 000、1 200 W[21,23]，提取時間5、10、15、20、25 min[24]，微波功率200、400、600、800、1 000 W[21,23]，進(jìn)行單因素實驗。通過計算糜子麩皮多酚提取量，確定響應(yīng)面分析實驗的因素水平范圍，優(yōu)化工藝條件。

1.3.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，選取選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲波功率4個因素為自變量，以多酚提取量為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平表

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取25 mg沒食子酸用蒸餾水溶解，定容至25 mL，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用蒸餾水定容至5 mL，得到濃度梯度為0、80、160、240、320、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取250 μL各標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，再加入1 mL蒸餾水和250 μL福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸餾水，室溫下避光放置1.5 h后，測定765 nm處的吸光值。以沒食子酸濃度為橫縱標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸后得到?jīng)]食子酸濃度與吸光值的方程為：y=0.003 8x+0.074 5，R2=0.994 7。

1.3.4 糜子麩皮中多酚含量的測定

吸取250 μL提取液于試管中，再加入1 mL蒸餾水和250 μL福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸餾水，室溫下避光放置1.5 h后，測定765 nm處的吸光值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出提取液中多酚的質(zhì)量濃度，并依照式(1)計算糜子麩皮中多酚提取量，以每克糜子麩皮粉中的沒食子酸質(zhì)量(毫克)表示。

(1)

式中：C為多酚濃度/mg/mL；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 糜子麩皮多酚體外抗氧化活性測定1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

取2 mL樣品多酚提取液，分別加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液 2 mL，溫室避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定反應(yīng)溶液的吸光度值[25]。按式(2)計算清除率，其中：A0為樣品溶液用等體積的無水乙醇代替測定的吸光度值；Ai為樣品溶液的吸光度值；Aj為DPPH溶液用等體積的無水乙醇代替測定吸光度值。

(2)

1.3.5.2 羥自由基清除率的測定

分別取不同濃度樣品，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，37 ℃恒溫水浴1 h，在510 nm下測定吸光度值A(chǔ)1，以蒸餾水為參比溶液，測定吸光度值A(chǔ)0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測定吸光度值A(chǔ)2[26]。按式(3)計算羥自由基清除率。

(3)

1.3.5.3 超氧自由基清除率的測定

取4.5 mL Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液于試管中，在20 ℃水浴預(yù)熱20 min后，分別加入不同濃度的多酚樣品溶液0.1 mL和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，搖勻后用蒸餾水補(bǔ)充至10 mL。置于25 ℃水浴反應(yīng)5 min，取出后立即加入1 mL 8 mol/L HCl，于325 nm處的吸光度Ai?？瞻滓哉麴s水代替樣品溶液，測定吸光度A0；考慮到樣品液本底的影響，同時測定不加鄰苯三酚溶液的相同濃度的樣品溶液的吸光度Aj[27]。按式(4)計算超氧自由基清除率。

(4)

1.3.5.4 還原力的測定

取30 μL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min后急速冷卻，取出再加入10%三氯乙酸2.5 mL。然后取2.5 mL上清液，加蒸餾水2.5 mL，加0.1%三氯化鐵0.5 mL，混勻。以蒸餾水為參比溶液于700 nm處測定吸光值[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子麩皮中多酚提取的單因素實驗結(jié)果

由圖1a可知，隨著液料比的增大，糜子麩皮多酚的提取量逐漸升高，當(dāng)液料比增大到40∶1時，提取量最大。濃度差是浸出成分在擴(kuò)散階段的主要推動力，隨著提取溶劑用量的增加，提高了濃度差，加強(qiáng)了傳質(zhì)推動力，從而增加了糜子麩皮中多酚的提取量[29]。繼續(xù)增加溶劑用量，糜子麩皮多酚提取量稍有增加，但是增加量不大，考慮到溶劑成本以及后續(xù)蒸發(fā)濃縮的便利，液料比以40∶1左右為宜。

圖1 單因素實驗結(jié)果

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，糜子麩皮多酚提取量逐漸增大，可能是因為在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，乙醇可以破壞細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部將酚類物質(zhì)溶出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時，糜子麩皮多酚提取量達(dá)到最大；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼升高時，提取量反而下降，主要是因為乙醇會引起蛋白質(zhì)變性在細(xì)胞壁形成致密結(jié)構(gòu)而阻礙酚類物質(zhì)的溶出[30]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)以60%為宜。

糜子麩皮多酚的提取量隨浸提溫度的升高而逐漸升高。溫度升高時，分子運(yùn)動加快，氫鍵更容易斷裂，有利于多酚類物質(zhì)的滲透和擴(kuò)散。在85 ℃時提取量達(dá)到最大值。但是，此時已經(jīng)高于乙醇沸點(diǎn)，會導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，并且溫度越高，會越加大多酚氧化的可能性。因此，選擇適宜的溫度為75 ℃。

由圖1b可知，糜子麩皮多酚提取量隨著超聲波的功率的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。超聲波功率越大，其空化作用和機(jī)械作用就越強(qiáng)，細(xì)胞組織被分解的更加徹底，粒子運(yùn)動不斷加快，從而有助于多酚物質(zhì)的溶出，在功率為1 000 W時提取量最高，而后提取量則下降。這可能與大功率的輻射使部分多酚類物質(zhì)受到破壞，發(fā)生降解有關(guān)。因此，超聲波功率以1 000 W為宜。

當(dāng)提取時間為10 min 時，糜子麩皮多酚提取量達(dá)到最大；當(dāng)提取時間再延長時，提取量則有所下降，這可能是由于過長時間的超聲波-微波的協(xié)同作用會破壞多酚結(jié)構(gòu)，同時伴隨多酚的部分氧化，從而使提取量降低。因此，適宜的提取時間為10 min。

不同微波功率對糜子麩皮多酚提取量影響較小。微波功率越大，越有助于物料內(nèi)部升溫。分子之間劇烈碰撞產(chǎn)生的大量摩擦熱導(dǎo)致局部壓力變大，迫使細(xì)胞破裂，從而有利于內(nèi)容物的釋放。當(dāng)微波功率為200 W時，得到了較高的多酚提取量。在200 W之后，糜子麩皮多酚的提取量減少，這可能是由于微波功率上升產(chǎn)生的局部過熱破壞了部分多酚的結(jié)構(gòu)，致使多酚的提取量下降[31]。從本實驗結(jié)果來看，選擇微波功率200 W為宜。

微波功率對于糜子麩皮多酚的提取量的影響較小，考慮到能源消耗和經(jīng)濟(jì)成本，不再對其進(jìn)一步優(yōu)化。而對于因素提取時間來說，在10 min時已經(jīng)達(dá)到較高的提取量，之后隨著時間延長一直呈下降趨勢。因此，也不再對其進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

以糜子麩皮多酚提取量為響應(yīng)值，以A液料比、B乙醇體積分?jǐn)?shù)、C提取溫度、D超聲波功率進(jìn)行四因素三水平中心組合實驗，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸方程的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型方程為：

Y=7.51+0.57A+0.033B+0.45C+0.059D+0.042AB+0.17AC+0.22AD+0.060BC-0.027BD+0.15CD-0.13A2-0.43B2+0.26C2-0.21D2

對模型方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方差分析表

由表3可以看出，F(xiàn)模型=18.91，P模型<0.01，說明上述建立的模型顯著；F失擬項=2.65，P失擬項=0.180 6>0.05，失擬項不顯著，說明可以用本實驗的二次回歸方程對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。決定系數(shù)R2=0.949 8，說明理論值與實際值擬合良好。通過比較F值的大小可知，各因素對糜子麩皮多酚提取量的影響大小分別為：液料比(A)>提取溫度(C)>超聲波功率(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)。各因素的二次項中，除了因素A2項外，其余因素的二次項對糜子麩皮多酚的提取量均有顯著影響。交互項中，AD的P<0.05差異顯著，說明液料比與超聲波功率之間的交互作用顯著。

2.2.3 驗證性實驗

響應(yīng)面實驗預(yù)測的最佳提取條件為：在液料比50∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)61.28%，溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W?？紤]到實際操作，將結(jié)果調(diào)整為：液料比50∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W，微波功率為200 W，提取時間10 min。在此條件下，多酚提取量理論預(yù)測值為9.06 mg/g。通過實驗證實，提取量為8.92 mg/g，與理論值一致。實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地預(yù)測糜子麩皮中多酚提取量。

2.3 糜子麩皮多酚抗氧化活性分析

由圖2可知，在質(zhì)量濃度為0.4～2.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，糜子麩皮多酚對DPPH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率可達(dá)92.41%，略低于1 mg/mL的VC清除率(95.40%)。經(jīng)計算，糜子麩皮多酚的清除DPPH自由基的IC50值為0.006 mg/mL。

圖2 糜子麩皮多酚抗氧化結(jié)果

當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.7 mg/mL時，該多酚對于羥自由基的清除率增加緩慢，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.7mg/mL時，該多酚對羥自由基的清除率達(dá)到了最大值，為69.22%。但是，該多酚對羥自由基的清除率要低于1 mg/mL的VC清除率(92.97%)。經(jīng)計算，糜子麩皮多酚清除羥自由基的IC50值為0.142 mg/mL。

不同質(zhì)量濃度的糜子麩皮多酚對超氧自由基的清除能力較低，在質(zhì)量濃度為0.1～0.9 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，該多酚對超氧自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)達(dá)到0.9 mg/mL時，清除率為24.41%，遠(yuǎn)低于1 mg/mL的VC清除率(94.46%)。經(jīng)計算，糜子麩皮多酚的清除超氧自由基的IC50值為12.048 mg/mL。

在質(zhì)量濃度為0.1～0.9 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，糜子麩皮多酚的還原力隨著樣品濃度的增加而增加，與濃度有較好的線性關(guān)系。當(dāng)達(dá)到0.9 mg/mL時，OD700為0.689，低于1 mg/mL的Vc吸光值1.422。經(jīng)計算，糜子麩皮多酚的還原力IC50值為4.022 mg/mL。

糜子麩皮多酚含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧自由基清除率和還原力的相關(guān)系數(shù)r與p值如表4所示。由表4可知，除羥自由基清除率與多酚呈顯著正相關(guān)(P<0.05)外，DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率和還原力與多酚均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。表明糜子麩皮多酚與抗氧化活性之間密切相關(guān)，這與臧盛等[19]認(rèn)為糜子殼粉中不同存在形式的多酚物質(zhì)均具有抗氧化活性的結(jié)果相一致。

表4 抗氧化活性與多酚的Pearson相關(guān)分析結(jié)果

3 結(jié)論

采用超聲波-微波協(xié)同方法提取糜子麩皮中的多酚，應(yīng)用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計進(jìn)行工藝優(yōu)化，最終確定最佳工藝條件為：液料比50∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W，微波功率為200 W的條件下提取10 min。在此工藝條件下，糜子麩皮中多酚的提取量為8.92 mg/g，與理論值9.06 mg/g接近，說明該提取工藝準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于糜子麩皮中多酚的提取。抗氧化活性實驗表明，該多酚對DPPH自由基清除率，羥自由基清除率，超氧自由基清除率和還原力的IC50值分別為0.006、0.142、12.048、4.022 mg/mL，并且各個抗氧化活性指標(biāo)和糜子麩皮多酚間均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。