王雪敏，李明珠，李佳佳，薛曉陽，周守長（河北邯鄲華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司 057150）

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

對不同兩個場區(qū)， 分別用兩種方法進(jìn)行同一種疫苗免疫，通過HI 抗體檢測，評價免疫方法。

2 實(shí)驗(yàn)材料及雞群

試驗(yàn)雞群，某種雞場A301 批次，420 日齡；某種雞場B301批次，415 日齡。 免疫疫苗，T3 新支二聯(lián)活疫苗 （VGGA+ma5+QX）。

3 實(shí)驗(yàn)分組

3.1 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)組一（A 場）：某種雞場A301 批次中固定30 只雞，用T3 新支二聯(lián)活疫苗（VGGA+ma5+QX)進(jìn)行點(diǎn)眼免疫，免疫劑量為1 羽份，另固定飲水免疫的30 只雞作為試驗(yàn)對比對象，免疫劑量為2 羽份。

試驗(yàn)組二 （B 場）： 某種雞場B301 批次中固定30 只雞，用T3 新支二聯(lián)活疫苗（VGGA+ma5+Q)進(jìn)行點(diǎn)眼免疫，免疫劑量為1 羽份，另固定飲水免疫的30 只雞作為試驗(yàn)對比對象，免疫劑量為2 羽份。

3.2 檢測時間

分別在免疫前1d、免疫后16d、免疫后30d 檢測進(jìn)行采樣，采樣雞只包括固定的30 只點(diǎn)眼雞只，以及固定的飲水免疫的30只雞，通過HI 抗體檢測。

4 檢測方法

4.1 物品準(zhǔn)備

一次性96 孔V 型反應(yīng)板，移液器（配有一次性槍頭；待檢血清； 試驗(yàn)抗原； 生理鹽水； 公雞紅細(xì)胞；100μL 單道移液器；100μL 八道移液器； 一次性移液器吸頭；9cm 直徑玻璃平皿；一次性96 孔v 型板；微量振蕩器；離心機(jī)；10mL 離心管；一次性手套、一次性口罩、記號筆等材料。 ）

4.2 抗凝劑、1%雞紅細(xì)胞配比

采血：5mL 注射器吸取1mL 配置好濃度為3.8%的檸檬酸鈉抗凝劑，采用翼根靜脈方法進(jìn)行采血。

紅細(xì)胞的洗滌：將采集好的抗凝血注射到10mL 離心管中，向離心管中加滿生理鹽水并混勻， 放入離心機(jī)內(nèi)配平，3000rpm離心3min 后，棄掉上清，重復(fù)清洗3 次，離心后得到的紅細(xì)胞沉淀加入生理鹽水后放置4℃冷藏備用。

抽出所需的生理鹽水， 并從中抽出棄去紅細(xì)胞所占量，即紅細(xì)胞與生理鹽水比例為1∶100，用移液器插入含有紅細(xì)胞離心管的底部進(jìn)行抽取紅細(xì)胞，加入生理鹽水，反復(fù)吹吸混勻備用。

4.3 實(shí)驗(yàn)操作細(xì)則

4.3.1 血液凝集（HA）試驗(yàn)采用96 孔板微量法操作。

4.3.1.1 在微量反應(yīng)板上， 從第1 孔加生理鹽水， 依次加到12 孔，每孔分別加入生理鹽水0.025mL。

4.3.1.2 在第1 孔按照生理鹽水與抗原1∶1 的比例加入25μL 的抗原，充分震蕩成均勻的混懸液。

4.3.1.3 第一孔混懸液震蕩均勻后， 從第1 孔吸取25μL 混懸液加入到第12 孔，依次倍比倍稀釋至11 孔，再從第11 孔吸出25μL 懸液連同槍頭一起丟棄。

4.3.1.4 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液， 每孔依次加入25μL充分震蕩混勻。

4.3.1.5 振蕩混勻后，在25℃的室溫下靜置20min 后觀察其結(jié)果，陽性對照孔的紅細(xì)胞完全凝集。

4.3.1.6 結(jié)果判定： 微量板靜置20min 后，2min 內(nèi)讀取血液凝集結(jié)果， 紅細(xì)胞凝集抑制呈現(xiàn)明顯的淚滴流淌狀。 完全血凝（不流淌）的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。

4.3.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）

4.3.2.1 根據(jù)1 試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU 的病毒抗原。 以完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)作為一個抗原的效價， 稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU 的抗原的稀釋倍數(shù)。 例如：如果血凝的終點(diǎn)滴度為1∶256，則4HAU 抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶64（256 除以4）。

4.3.2.2 在一次性板的1～12 孔加入25μL 的生理鹽水。

4.3.2.3 抽取25 微升血清加入第1 孔內(nèi)， 充分混勻后吸取25μL 于第2 孔，依次對倍稀釋至11 孔，從第11 孔吸取25μL 棄去。

4.3.2.4 1～11 孔均加入含4HAU 混勻的抗原液25μL， 振蕩混勻，室溫（約20℃～25℃）靜置25min。

4.3.2.5 每孔加入25μL 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫（約20℃～25℃）靜置25min，對照孔紅細(xì)胞將呈明顯紐扣狀沉于孔底。

4.3.2.6 結(jié)果判定

以完全抑制4 個抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI 滴度。

附錄HA 和HI 試驗(yàn)用溶液的配制

1%雞紅細(xì)胞懸液制備：

采集至少3 只無免疫的健康公雞的血液與抗凝劑4∶1 混合，用生理鹽水洗滌3 次左右，前兩次用2000r/min 離心3min，最后一次以2500r/min 離心3min，洗滌后用生理鹽水配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果詳見表1。 通過表1 可見：在本次試驗(yàn)中，使用飲水免疫后，ND 抗體水平未有明顯變化， 抗體離散度從數(shù)值上看有下降趨勢，但從抗體滴度跨度看，沒有顯著影響。 使用點(diǎn)眼免疫后，ND 抗體均呈現(xiàn)小幅度升高趨勢， 且離散度得到較好的改變。

表1 不同免疫方式抗體效果規(guī)律

6 結(jié)果分析

6.1 當(dāng)ND 抗體水平在8～9 時，不管采取飲水免疫或點(diǎn)眼免疫，均不能使抗體水平獲得較大幅度的提高。

6.2 從抗體上升幅度以及離散度改善程度看，本次飲水免疫均未起到明顯的效果，可認(rèn)為是免疫失敗。 而點(diǎn)眼免疫在改善離散度方面起到較好的作用。

6.3 本次飲水免疫的失敗，可能由以下兩方面導(dǎo)致：當(dāng)前的規(guī)模和設(shè)備不適合使用飲水免疫的方法。 飲水免疫操作失敗。

6.4 在當(dāng)前規(guī)模養(yǎng)殖條件下， 飲水免疫存在較大的不確定性，如何提高飲水免疫效果，需要探討。