鄧薈芬, 劉 艷, 揭紅東, 馬玉申, 何鵬亮, 黃麗娟, 林子群,邢虎成, 揭雨成*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學苧麻研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南省草類作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125；3. 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院，湖南 長沙 410127)

苧麻(Boehmerianivea) 是蕁麻科苧麻屬多年生作物[1]，是傳統(tǒng)的纖維作物。在我國南方，高蛋白飼草缺乏，嚴重制約著畜牧業(yè)的發(fā)展。苧麻的蛋白質(zhì)含量高，年生物產(chǎn)量大，有望成為今后重要的植物蛋白質(zhì)飼料來源[2]。但是，苧麻含有大量木質(zhì)纖維素，工業(yè)化加工困難，動物消化吸收困難，尋求能高效降解苧麻木質(zhì)纖維素的方法至關(guān)重要。青貯是對苧麻安全保存的有效方法，并且在發(fā)酵過程中可以進行木質(zhì)纖維素的生物降解。青貯過程中添加纖維素酶制劑，可以降解木質(zhì)纖維素含量，提高家畜利用效率[3]。但是酶制劑成本高，降解效果有限[4]，不適于大規(guī)模生產(chǎn)使用。

近年來，高產(chǎn)纖維素酶微生物的研究受到高度關(guān)注。曲霉菌屬是絲狀真菌中著名的高產(chǎn)纖維素酶菌屬之一，黑曲霉(Aspergillusniger)屬于曲霉菌屬，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、木質(zhì)素降解酶等多種酶[5-6]，多種酶共同作用可以高效降解生物質(zhì)，且安全、無毒素。任付平等[7]通過添加黑曲霉菌等對玉米(Zeamays)進行青貯，處理組中性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和酸性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)的含量比對照組分別降低了13.81%和12.67%。

劉洋等[8]在苜蓿(Medicago)鮮草中添加麥麩進行青貯可以控制青貯水水分，提高營養(yǎng)品質(zhì)，ADF和NDF含量顯著低于添加統(tǒng)糠的處理，本試驗在混合青貯中通過添加麥麩來調(diào)節(jié)青貯原料的含水量。本研究通過添加不同濃度(質(zhì)量體積比)黑曲霉菌液對飼用苧麻與麥麩進行混合發(fā)酵，探究不同濃度黑曲霉菌液對飼用苧麻青貯營養(yǎng)成分、品質(zhì)和木質(zhì)纖維素降解效果的影響，尋求黑曲霉菌液最佳添加量，并通過研究在發(fā)酵過程中主要幾種相關(guān)酶活的動態(tài)變化，為黑曲霉菌在青貯中降解植物木質(zhì)纖維素的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗青貯苧麻原料為‘湘飼纖兼用1號’，在湖南農(nóng)業(yè)大學耘園基地種植。收割時間2018年5月20日，刈割高度株高60 cm左右，全株切碎至1～2 cm待用。麥麩由臨泉縣金禾面粉有限公司生產(chǎn)，白砂糖購自湖北惠林食品有限公司，青貯原料營養(yǎng)成分見表1。黑曲霉由本實驗室提供。

表1 青貯原料營養(yǎng)成分Table 1 Nutrition content compositions of ensilage materials

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用單因素完全隨機設(shè)計。在每千克苧麻與麥麩(80%苧麻+18%麥麩+2%蔗糖)混合青貯中分別添加50 mL黑曲霉菌液(濃度為5.68×106CFU·mL-1)+150 mL無菌水(Ⅰ)、100 mL黑曲霉菌液+100 mL無菌水(Ⅱ)、150 mL黑曲霉菌液+50 mL無菌水(Ⅲ)、200 mL黑曲霉菌液(Ⅳ)、200 mL無菌水為對照組(CK)，每組6個重復(fù)。

按最佳處理配方將青貯材料混合均勻后裝入青貯袋中，抽真空后封口。常溫下青貯0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d后開包，對青貯材料進行酶活檢測，每個時間點測定3個重復(fù)。

1.3 試驗方法

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成：麩皮40 g·L-1，豆粉餅15 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，MgSO4·7H2O22 g·L-1。將黑曲霉菌用接種環(huán)接種到PDA液體培養(yǎng)基中，放置于振蕩培養(yǎng)箱中32℃，170～180 r·min-1培養(yǎng)6 d。

黑曲霉計數(shù)：在接種液中加入玻璃珠，振蕩器振蕩后用3層紗布紗布過濾，過濾得到孢子懸浮液，然后用無菌水對其逐級稀釋，采用血球計數(shù)板計數(shù)得到黑曲霉孢子濃度。黑曲霉菌液濃度為5.68×106CFU·mL-1。

培養(yǎng)結(jié)束后1～2 h內(nèi)將不同濃度黑曲霉菌液均勻噴灑在青貯料上并攪拌均勻，青貯材料放入聚乙烯真空袋中抽真空密封后進行發(fā)酵。每袋400 g，室溫條件下發(fā)酵30 d后開包進行檢測。

1.4 測定項目及方法

干物質(zhì)(Dry matter,DM)、粗脂肪(Ether extract,EE)、粗蛋白(Crude protein,CP)含量檢測方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)(第4版)》[9]。蒽酮比色法[10-11]測定可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)。范氏洗滌纖維法[12-13]測定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌木質(zhì)素(Acid detergent lignin,ADL)含量。

利用pH計(雷磁PHS-3C型)測定pH[14]；氨態(tài)氮(Ammoniacal nitrogen,NH3-N)采用苯酚-次氯酸比色法測定[15]；氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acid,VFA)[16]；參照V-Score評分體系及V-Score分數(shù)分配計算標準對各處理進行評分[17]。對不同發(fā)酵時間的青貯進行酶活檢測。青貯羧甲基纖維素酶(Carboxymethyl cellulose,CMC)活性檢測方法參考索萊寶CMC活性檢測試劑盒說明書；錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)活性檢測方法參考索萊寶Mnp活性檢測試劑盒說明書；漆酶活性檢測方法參考索萊寶漆酶活性檢測試劑盒說明書；木聚糖酶活性檢測方法參考索萊寶木聚糖酶活性檢測試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表2可知，與對照組相比，各處理組的DM，WSC含量都有顯著升高(P<0.05)，且處理Ⅰ組、處理Ⅱ組DM，WSC含量顯著高于處理Ⅲ組和處理Ⅳ組(P<0.05)；各處理組與對照組間CP及EE含量無顯著差異；與對照組相比，處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組的ADF，NDF和ADL含量顯著降低(P<0.05)。

表2 各處理青貯飼料營養(yǎng)成分含量Table 2 Nutrition composition of silage in each treatment

2.2 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯青貯品質(zhì)的影響

由表3可知，與對照組相比，處理Ⅰ組、處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組pH值都顯著降低(P<0.05)，且所有處理組都小于4.2，符合優(yōu)良青貯的要求；與對照組相比，各處理組的LA含量顯著增加(P<0.05)、AA含量和氨態(tài)氮/總氮比值顯著降低(P<0.05)；對照組和各處理組間的PA含量無顯著差異；對照組和各處理組在發(fā)酵過程中均未檢測到BA；各處理組V-Score評分都在90分(良好水平)以上，高于對照組。

表3 各處理青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)比較Table 3 Comparison of fermentation quality of ramie silage in different treatments

2.3 添加10%黑曲霉菌液進行苧麻混合青貯不同時間酶活性的變化

對添加10%黑曲霉菌液的苧麻混合青貯0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d錳過氧化物酶(MnP)、漆酶、羧甲基纖維素酶(CMC)和木聚糖酶4種酶的活性進行檢測。由圖1中A～D可知，MnP活性在0 d為344.24 u·L-1，在發(fā)酵前7 d持續(xù)下降，且下降幅度較大，第7 d比初始酶活下降了78.90%，15 d以后MnP活性基本維持穩(wěn)定狀態(tài)，第30 d MnP活性為24.23 u·L-1，比初始值下降了92.96%；漆酶活性在第0 d為26.04 u·mL-1，第1 d比初始值升高了162.29%，第1 d以后酶活開始下降，第7 d比第1 d酶活下降了78.95%，第7 d比初始值下降了44.78%，15 d以后下降速度大幅減緩，第30 d漆酶活性為14.31 u·mL-1，比初始值下降了45.04%；木聚糖酶在第0 d為 19.42 u·mL-1，發(fā)酵第1 d比初始酶活小幅上升了11.12%，第1 d以后開始下降，第7 d比初始酶活下降了54.43%，15 d以后木聚糖酶下降速度減緩，第30 d木聚糖酶活酶活為3.39 u·mL-1，比初始值下降了82.54%；CMC活性在0 d為98.48 u·mL-1，發(fā)酵前7天持續(xù)下降，且下降幅度較大，第7 d比初始酶活下降了76.72%，15 d以后CMC活性持續(xù)下降，但下降幅度減緩，第30 dCMC活性為8.31 u·mL-1，比初始值下降了91.56%。

圖1 不同發(fā)酵天數(shù)苧麻青貯中酶活性差異Fig.1 Differences in enzyme activities in castor silage under different fermentation days

3 討論

3.1 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯營養(yǎng)成分影響

黑曲霉在有氧發(fā)酵過程中可產(chǎn)生豐富的胞外酶，本試驗檢測到的有CMC，MnP、漆酶和木聚糖酶(半纖維素酶)。纖維素酶和木聚糖酶(半纖維素酶)有降解NDF和ADF的作用，可以把植物細胞壁的纖維素分解為單糖和雙糖[18]；MnP、漆酶等是主要的木質(zhì)素降解酶[19]。張雪蕾等[20]通過添加纖維素酶進行苧麻青貯，發(fā)現(xiàn)隨著纖維素酶添加水平的增加，苧麻青貯中的NDF和ADF呈下降趨勢。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，添加了黑曲霉的各處理組WSC含量顯著升高，NDF，ADF和ADL含量不同程度降低，并且處理Ⅱ組、處理Ⅲ組、處理Ⅳ組明顯優(yōu)于處理Ⅰ組對NDF，ADF和ADL的降解效果，可能是由于處理Ⅰ組中胞外酶的總量較少，所以降解效果較差。處理Ⅱ組、處理Ⅲ組和處理Ⅳ組NDF，ADF和ADL的降解效果無明顯差異，推測是因為黑曲霉菌液添加量超出10%以后，各種酶的降解作用已發(fā)揮到極限，黑曲霉菌液的添加量與NDF，ADF和ADL的降解效果無正相關(guān)性。

3.2 添加不同濃度黑曲霉菌液對苧麻青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

目前，青貯主要是添加乳酸菌作為發(fā)酵促進劑，在厭氧環(huán)境中通過乳酸菌的繁殖產(chǎn)生酸性環(huán)境，使青飼料得以長久保存。我們通過多次預(yù)試驗證明，在不添加乳酸菌情況下，苧麻青貯仍可在短期內(nèi)形成酸性環(huán)境，且各組的pH均在4.2以下，符合優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求[21]，推測苧麻本身帶有豐富的乳酸菌。處理組pH值顯著低于對照組，可能是黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶等能將植物細胞壁的纖維素分解為乳酸菌繁殖提供所需營養(yǎng)，從而提高了LA的含量使pH值降低。任付平等[7]利用微生物對玉米進行青貯，發(fā)現(xiàn)黑曲霉等微生物將玉米中的纖維降解為寡糖和單糖，為菌體生長提供豐富的營養(yǎng)環(huán)境，從而提高了LA的含量。魏曉斌等[22]通過添加乳酸菌和纖維素酶對苜蓿進行青貯，發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌和纖維素酶可以彌補苜蓿原料乳酸菌與可溶性糖不足，顯著提高LA含量，顯著降低AA含量。李順等[23]通過添加糖蜜和纖維素酶對籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)進行混合青貯，能極顯著降低籽粒莧與麥麩混合青貯的NH3-N/TN值。本試驗中，我們通過添加黑曲霉及菌液補充了復(fù)合酶，與對照組相比，各處理組提高了LA含量、降低了AA含量；與對照組相比，處理組因添加黑曲霉及菌液在復(fù)合酶的作用下NH3-N/TN值顯著降低，與前人的研究結(jié)果一致。

3.3 添加黑曲霉菌液進行苧麻青貯對不同時間酶活性的影響

黑曲霉為好氧菌，青貯發(fā)酵早期大量繁殖，產(chǎn)生大量分解底物的酶類物質(zhì)，迅速消耗原料中的氧氣，使青貯飼料進入無氧狀態(tài)，菌體的活動還可以提高青貯料的溫度，從而抑制其它好氧腐敗菌在青貯料中的生長繁殖[6]。在本研究中，漆酶和木聚糖酶在發(fā)酵第一天有不同程度的上升，說明黑曲霉在發(fā)酵初期利用了青貯袋中殘留的氧氣進行了有氧發(fā)酵產(chǎn)生了胞外酶。左颯颯等[24]利用白腐菌進行玉米秸稈的降解，在有氧條件下進行發(fā)酵，木質(zhì)素及纖維素酶都隨著發(fā)酵時間的延長而升高。本研究在發(fā)酵初期也因少量氧氣存在，漆酶和木聚糖酶有酶活升高的現(xiàn)象，而后隨著時間的延長持續(xù)下降；CMC，MnP活性在發(fā)酵過程中持續(xù)下降。黑曲霉為好氧菌，隨著發(fā)酵時間的延長，氧氣被耗盡，無法進行發(fā)酵產(chǎn)生胞外酶，故酶活力逐步降低[25]。但4種酶在發(fā)酵30 d時仍有少量存在，對混合青貯的木質(zhì)纖維素降解起到了關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

通過添加黑曲霉菌液對飼用苧麻進行青貯，不同程度降低了混合青貯中的NDF，ADF和ADL，提高了苧麻青貯的發(fā)酵品質(zhì)。降解效果以處理組Ⅱ(即每千克混合青貯中添加100 mL黑曲霉菌液+100 mL無菌水)為最佳。黑曲霉在青貯前期短暫時間內(nèi)有氧條件下使漆酶和木聚糖酶酶活有所上升，后期各酶酶活持續(xù)下降，15 d后下降幅度趨緩慢。黑曲霉是苧麻進行青貯發(fā)酵的優(yōu)良促進劑，可提高發(fā)酵飼料品質(zhì)。