單旭東，高婭楠，張桐瑞，程 錦，許立新

(北京林業(yè)大學草業(yè)與草原學院，北京100083)

結(jié)縷草(Zoysiajaponica)因具有耐旱、耐鹽堿、耐熱、耐踐踏、抗病、養(yǎng)護成本低等特性，在草坪草應用中深受歡迎，廣泛用于公園、球場、公路護坡等綠地建植[1]，但其在北方冬季脅迫下較早進入枯黃期，這使其進一步推廣使用受到限制。

研究者認為，造成草坪草冬季脅迫的兩大原因是低溫和干旱[2]。國內(nèi)外已有許多學者對如何減小冬季脅迫和延緩草坪枯黃期進行了大量的研究[3]，如篩選抗寒基因[4-5]、培育抗寒品種、科學的控制水肥[6-7]、噴施激素[8-9]以及建設地下供暖系統(tǒng)對草坪加溫[10-11]從而推遲草坪枯黃期。然而，這些方法存在不同程度的耗時、耗力、耗錢的問題。本試驗采用省時、省力、省錢的保溫和澆水的方法對結(jié)縷草進行處理，研究3種處理對冬季脅迫下結(jié)縷草生理生化特征的影響，探索結(jié)縷草冬季脅迫響應機制，為草坪保溫技術(shù)提供應用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2019年10月至11月在北京市昌平區(qū)北京林業(yè)大學草坪試驗基地(東經(jīng)116°14′，北緯40°10′)進行，該地區(qū)屬于暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，平原地貌，平均海拔52 m，平均日照時數(shù)2 684 h，年均氣溫11.8℃，年均降水量550.3 mm。根據(jù)國家氣象科學數(shù)據(jù)中心[12]查詢得到試驗所在地區(qū)近3年氣溫的變化對照(表1)。

表1 試驗地所在地區(qū)近3年自然氣溫變化對比Table 1 Comparison of natural temperature change in the area where the test site is located in the past three years

1.2 試驗材料

供試結(jié)縷草品種為‘Zenith’，原材料建植于2015年，建植方式為鋪草皮。2019年6月進行草皮的移栽，在原草坪的中心區(qū)域取16個30 cm×30 cm面積的草皮，移栽至試驗區(qū)域，試驗小區(qū)面積為1 m2，小區(qū)間距50 cm。草坪移栽后按氮素施用量5 g·m-2在表層一次性施入緩釋復合肥(N∶P2O5∶K2O =19∶6∶12)作為底肥，在此之后不再施肥。日常澆水養(yǎng)護，定期人工拔除雜草，每月修剪一次，修剪高度約為15 cm，橫向自由擴繁。

1.3試驗設計

采用添加保溫棚的方式做保溫處理。保溫棚長寬高為1 m×1 m×0.5 m，骨架為不銹鋼管，棚膜為PVC材質(zhì)，無色透明，防風透光性良好，添加保溫棚比覆蓋聚乙烯薄膜更具優(yōu)勢，可以保留較高的修剪高度，不會對結(jié)縷草草坪造成物理壓迫。

試驗采用隨機區(qū)組設計，共4個處理，分別是保溫充足澆水處理(Temperature and Watering，TW)，保溫不澆水處理(Temperature Preserture，T)，無保溫充足澆水處理(Watering，W)，無保溫不澆水處理即對照組(Control Check,CK)，每個處理4個重復，共有16個小區(qū)。2019年10月14日，進行保溫棚的安裝，10月14日至10月27日，每隔3天，將所有小區(qū)都充分澆水，每次澆水量統(tǒng)一為10 kg·m-2。10月27日起T和CK處理組停止?jié)菜琓W和W處理保持充足澆水。分別在10月27日，11月1日，11月6日，11月12日，11月19日進行5次取樣，取適量成熟展開葉的中間部分，放入自封袋并做好標記后放入冰盒保鮮，帶回實驗室立即測定生理指標。取適量成熟展開葉的中間部分用錫箔紙包裹并做好標記放入液氮中，帶回實驗室，放入-80℃冰箱保存，用于抗氧化酶活性的測定。

1.4 測定指標和方法

氣溫使用煤油溫度計(型號：國標-20～100℃，廠家：衡水正旭電子科技有限公司)測定。土壤含水量(%)使用土壤水分速測儀(型號：TZS-Ⅰ，廠家：浙江托普儀器有限公司)進行測定。葉片相對含水量(relative water content，RWC)采用烘干法[13]測定。相對電導率采用Blum和Ebercode的方法[14]測定。單位面積葉片枯黃比例使用網(wǎng)格針刺法測定，調(diào)查200個1 cm2方格中枯黃葉片的方格比例，用于衡量植株進入枯黃的狀態(tài)。葉綠素含量采用分光光度法[14]測定。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[15]測定?？寡趸富钚詼y定[16]：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性使用氮藍四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)光化還原法(單位：U·g-1DW，DW(dry weight)代表葉片干重)，以觀察甲棕的顏色為時間參考，觀察直到樣品管中溶液呈淺紫色，立即使用UV-2600分光光度計測定其在560 nm波長下測定內(nèi)吸光度；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性使用愈創(chuàng)木酚氧化法(單位：U·mg-1DW)，定義1分鐘內(nèi)吸光度每變化0.01為酶活性的一個單位(U)；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性使用過氧化氫還原法(單位：U·g-1DW)，定義1分鐘內(nèi)吸光度每變化0.01為酶活性的一個單位(U)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行整理和圖表的繪制，使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，同時以Duncan(鄧肯)法對數(shù)據(jù)進行顯著性比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含水量和氣溫的變化

T處理組和CK組土壤含水量隨時間的變化而明顯降低(圖1)，T處理土壤含水量降低速度小于CK組，TW處理和W處理土壤含水量保持在25%～30%。TW和T處理氣溫高于W和CK處理組氣溫2.1～2.4℃(圖2)。

圖1 土壤含水量的變化Fig.1 The change of soil moisture content注：TW為保溫澆水處理，W為澆水處理，T為保溫處理，CK為空白對照。下同Note:TW is temperature and watering treatment,W is watering treatment,T is temperature treamtent. CK is control group,the same as below

圖2 氣溫的變化Fig.2 The change of air temperature

2.2 單位面積葉片枯黃比例

隨著冬季脅迫時間變化，所有處理組葉片枯黃比例均呈上升趨勢(圖3，圖4)，10月24日各處理間單位面積葉片枯黃比例差異不顯著。10月27日至11月6日，單位面積葉片枯黃比例由大到小依次是CK，T，W，TW。而11月6日后，枯黃比例從大到小依次是CK，W，T，TW。這表明，在10月27日至11月6日期間，澆水處理的效果大于保溫處理。11月12日至11月19日，W處理單位面積葉片枯黃比例大于T處理，這說明11月6日之后，保溫對結(jié)縷草枯黃的緩解作用大于澆水。

圖3 保溫和澆水處理對單位面積枯黃葉片比例的影響Fig.3 Effect of temperature preservation and watering treatment on the proportion of withered yellow leaves per unit area

圖4 保溫和澆水處理對冬季脅迫下結(jié)縷草葉片枯黃比例的影響Fig.4 Effects of heat preservation and water treatment on the ratio of withered and yellow leaves of Zoysia grass under winter stress

2.3 葉片相對含水量

冬季脅迫下，各處理組葉片相對含水量均呈下降趨勢(圖5)。10月27日和11月1日各處理間均無顯著差異。11月6日，TW處理葉片相對含水量顯著高于其他處理組(P<0.05)。11月12日，TW處理顯著高于其他處理組(P<0.05)，W和T處理差異不顯著，但顯著高于對照組(P<0.05)。11月19日，W處理和T處理差異不顯著，TW，W和T處理顯著高于對照組(P<0.05)。11月6日，CK處理組葉片相對含水量比11月1日顯著下降了5.04%(P<0.05)，11月12日，W和CK處理葉片相對含水量比11月6日均顯著下降(P<0.05)。11月19日，TW處理相比前4次取樣首次出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，CK組葉片相對含水量顯著下降(P<0.05)。從對照組葉片相對含水量的變化上可以看出冬季脅迫對結(jié)縷草葉片相對含水量有顯著的影響。TW處理可以減少冬季脅迫對葉片相對含水量的影響。

圖5 保溫和澆水處理對葉片相對含水量的影響Fig.5 Effect of heat preservation and watering treatment on relative water content of leaves注：不同小寫字母表示相同日期內(nèi)，不同處理差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示相同處理不同日期間的差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters show significant different between different treatments under the same date at the 0.05 level. Different capital letters indicated that there was significant difference between different dates of the same treatment at the 0.05 level,the same as below

2.4 相對電導率

冬季脅迫下，各處理組相對電導率均呈上升趨勢(圖6)，這表明冬季脅迫下，結(jié)縷草的膜透性加大，電解質(zhì)滲透加劇。10月27日，各處理間差異不顯著，11月1日T處理相對電導率出現(xiàn)顯著增長(P<0.05)，該日T處理的相對電導率顯著高于TW和W處理(P<0.05)，這表明在此時期水分對相對電導率的影響大于溫度。在11月6日之后，由于溫度持續(xù)降低，W處理相對電導率快速增長，其增長速度遠大于T處理，說明在此期間，溫度對相對電導率的影響大于水分。保溫和澆水處理(TW)相對電導率較為穩(wěn)定，TW組相對電導率始終低于T，W和CK組，由此可知，TW處理可以較好地緩解結(jié)縷草細胞膜的損傷。

圖6 保溫和澆水處理對相對電導率的影響Fig.6 Effect of heat preservation and watering treatment on relative electrolyte conductivity

2.5 葉綠素含量

冬季脅迫下，各處理葉綠素含量均呈下降趨勢(圖7)，其中CK組葉綠素含量下降速度最快，W處理組次之，TW和T處理組下降速度則較為緩慢。11月1日，W與CK處理葉綠素含量出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，TW和T處理組顯著高于CK組(P<0.05)。11月6日，TW與T處理葉綠素含量比11月1日均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，11月6日葉綠素含量從大到小依次是TW，T，W，CK。11月12日各處理間差異均顯著(P<0.05)，葉綠素含量從大到小依次是TW，T，W，CK。11月19日TW組顯著高于其他處理組(P<0.05)，T處理顯著(P<0.05)高于W和CK處理，W和CK處理間差異顯著(P<0.05)。

圖7 保溫和澆水處理對葉綠素含量的影響Fig.7 Effect of heat preservation and watering treatment on chlorophyll content

2.6 丙二醛(MDA)含量

隨著冬季脅迫程度的變化，各處理MDA含量均呈上升趨勢(圖8)，由此可知，冬季脅迫下結(jié)縷草的細胞膜損傷逐漸加重。10月27日，W和CK處理組MDA含量顯著高于TW和T組(P<0.05)。11月1日、11月6日、11月12日和11月19日TW處理組MDA含量都顯著低于CK處理組。T處理在11月6日和12日MDA含量無顯著差異，但高于W處理的MDA含量，這表明，在此期間，水分對MDA含量的影響大于溫度。各處理中，保溫澆水處理(TW)的MDA含量最低，這表明TW處理緩解了冬季脅迫對細胞膜的損傷。

圖8 保溫和施澆處理對丙二醛含量的影響Fig.8 Effect of heat preservation and watering treatment on malondialdehyde content

2.7 抗氧化酶活性

2.7.1SOD活性 10月27日TW與對照組間差異不顯著(圖9)，11月1日到11月19日TW處理組的SOD活性顯著高于其他處理組(P<0.05)。11月1日澆水處理(W)相比10月27日顯著下降443.97 U·g-1(DW)(P<0.05)，而T處理在11月1日顯著下降了458.89 U·g-1(DW)(P<0.05)，這表明在此期間，溫度和水分對SOD活性都有很大的影響。11月6日、11月12日期間，W處理組SOD活性的下降幅度大于T處理，且在11月12日之后，T處理的SOD活性都顯著高于W處理(P<0.05)，這表明在冬季脅迫的后期，溫度對SOD活性的影響大于水分。TW處理在所有處理中都維持在一個比較高的水平，由此可知，TW處理對冬季脅迫下結(jié)縷草SOD活性有顯著的影響。

圖9 保溫和澆水處理對SOD活性的影響Fig.9 Effect of heat preservation and watering treatment on SOD activity

2.7.3CAT活性 冬季脅迫下，TW,W和T處理CAT活性均呈先升后降趨勢(圖11)，CK組CAT活性呈持續(xù)下降的趨勢，表明冬季脅迫對結(jié)縷草CAT活性具有顯著的影響。W和T處理CAT活性都在11月1日即出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)，TW處理CAT活性首次顯著上升出現(xiàn)在11月6日(P<0.05)。11月6日至11月12日期間，W處理的CAT活性顯著高于T處理(P<0.05)，11月19日，W處理的CAT活性顯著低于T處理(P<0.05)。保溫和澆水處理對冬季脅迫下結(jié)縷草的CAT活性具有顯著影響(P<0.05)。

圖10 保溫和澆水處理對POD活性的影響Fig.10 Effect of heat preservation and watering treatment on POD activity

圖11 保溫和澆水處理對CAT活性的影響Fig.11 Effect of heat preservation and watering treatment on CAT activity

3 討論

3.1保溫和澆水處理對土壤含水量、氣溫和結(jié)縷草枯黃的影響

保溫覆膜技術(shù)在草地早熟禾(Poapratensis)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和花生(Arachishypogaea)等領(lǐng)域均有應用。研究表明，覆膜可以減小風力對溫度的影響，與大氣形成一定程度的隔離，從而增加溫度、減少土壤水分散失[17-20]，這也在一定程度上解釋了本研究中T處理土壤含水量下降速度小于CK組的原因。在隋虹杰等[21]的研究不同覆膜方式對高粱(Sorghumbicolor)生長發(fā)育的影響時發(fā)現(xiàn)，全覆膜處理可比不覆膜處理提升1.78～2.20℃，且全覆膜處理土壤含水量高于不覆膜處理，這與本研究結(jié)果相似，對草坪添加保溫處理可減小土壤水分蒸散速度、提高氣溫。

單位面積草坪枯黃比例和土壤含水量存在關(guān)聯(lián)性，土壤缺水會加快結(jié)縷草進入枯黃，當CK組土壤含水量低于5%時，其單位面積枯黃的比例為96.8%，W處理即使保證了水分供應，但因自然環(huán)境的持續(xù)降溫，11月19日測得W處理的單位面積枯黃比例也達到了91.3%之高。劉立軍等[22]的研究中，不同灌水水平處理下的高羊茅(Festucaarundinacea)枯黃率隨著自然溫度的降低都顯著增加(P<0.05)。因此，冬季脅迫后期，水分不再是影響結(jié)縷草單位面積枯黃比例的主要因素，其主要因素可能是溫度。

黃亮亮[23]的研究證實澆水處理能提高草坪草抗性，從而推遲枯黃期。本研究中對比W和CK處理發(fā)現(xiàn)，充足的澆水處理，能起到減緩結(jié)縷草葉片枯黃速度的作用，在11月6日之后，日均溫開始低于10℃，結(jié)縷草枯黃的速度加快，李超等[24]認為結(jié)縷草的生長臨界溫度為10℃，當溫度低于10℃時，結(jié)縷草將停止生長，并進入枯黃期，本研究進一步驗證了這一觀點。研究發(fā)現(xiàn)保溫澆水(TW)對冬季脅迫的緩解效果最好，這是因為該處理一方面保證了水的充分供給，另一方面是提高了氣溫。

3.2 保溫和澆水處理對冬季脅迫下結(jié)縷草生理指標的影響

W和T處理的葉片相對含水量在11月6日顯著降低(P<0.05)，同時W和T處理在此后的日期中，葉片相對含水量均顯著低于TW處理(P<0.05)，但W和T之間的葉片相對含水量差異不顯著，這表明水分脅迫和溫度脅迫均會使結(jié)縷草葉片相對含水量顯著降低(P<0.05)，但還不能得出水分和溫度哪種因素對葉片相對含水量的影響更大。T處理的葉片相對含水量在冬季脅迫的前期沒有顯著下降，而在冬季脅迫的后期隨著土壤含水量和溫度的下降，其葉片相對含水量也呈下降趨勢。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，只干旱處理不會造成多年生黑麥草(Loliumperenne)葉片相對含水量的下降，而在低溫下，干旱將造成多年生黑麥草葉片相對含水量下降[25]。保溫和澆水處理(TW)對冬季脅迫下結(jié)縷草電解質(zhì)滲透具有緩解作用，TW處理組相對電導率始終低于T,W和CK組，由此可知TW處理可以較好地緩解冬季脅迫對結(jié)縷草細胞膜的損傷。有研究表明，覆膜保溫能提高‘張雜谷3號’(Setariaitalica)的抗旱能力，降低谷子在旱期的丙二醛含量[26]；還有研究表明，覆膜提高了高丹草(Sudanense)的水分利用效率，因此降低了水分脅迫對高丹草丙二醛含量的影響[27]；韓瑤[28]的研究證實冬季對葡萄(Vitisvinifera)進行覆蓋，能減小冬季脅迫下葡萄的丙二醛增降幅度，提高葡萄越冬性能。本研究中，保溫澆水處理(TW)對丙二醛的緩解效果最顯著(P<0.05)，這是因為保溫和澆水提高了結(jié)縷草冬季脅迫下的代謝水平，減小了冬季脅迫對細胞膜的損傷。

范麗霞[29]的研究發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫時間的延長，結(jié)縷草葉綠素含量降-升-降的變化趨勢。而隋永超等[30]的研究表明，當土壤含水量下降到2%時，結(jié)縷草葉片葉綠素含量并沒有顯著下降，干旱條件下與正常澆水的結(jié)縷草葉綠素含量差異不顯著。本研究中通過觀察T處理的變化趨勢可知，葉綠素含量隨土壤含水量降低而降低，這與前人的研究結(jié)果不一致，這可能與試驗中的脅迫條件不同有關(guān)，T處理除土壤含水量降低的因素以外，在冬季脅迫的后期也存在溫度逐漸降低的因素，因此葉綠素含量逐漸下降。這也可能與結(jié)縷草葉齡有關(guān)，有研究指出植物光合作用的減弱與葉齡存在關(guān)聯(lián)性，衰老相關(guān)基因SAGs (senescence-associated genes)隨著葉齡的增加而表達水平上調(diào)，進而調(diào)控葉片衰老及細胞死亡，同時季節(jié)更替也是影響葉片葉綠素含量的重要因素之一[31]。本研究中在10月27日，W與T處理的葉綠素含量差異不顯著，而在11月6日之后，T處理的葉綠素含量始終顯著高于W處理(P<0.05)，這表明，結(jié)縷草葉綠素的代謝響應，在冬季脅迫整個過程中對溫度比對水分更加敏感。

3.3 保溫和澆水處理對冬季脅迫下結(jié)縷草抗氧化酶活性的影響

SOD是生物體系中抗氧化酶家族的重要一員，它能夠催化超氧化物質(zhì)產(chǎn)生歧化反應，使體內(nèi)超氧化物質(zhì)在維持一定水平，從而保護細胞[32]。冬季脅迫下，W處理組和對照組SOD活性呈減持續(xù)降低的趨勢，侯禎丹等[33]研究低溫脅迫對3種綠絨蒿(MeconopsisSPP.)生理生化指標的影響時發(fā)現(xiàn)，在人工模擬低溫(4℃)條件下，3種綠絨蒿的SOD活性均呈先升后降的趨勢，對比這兩種SOD的變化趨勢有所不同，這有兩種可能，一是本研究中的溫度脅迫是一個自然環(huán)境下的動態(tài)脅迫，而不是人工設定的持久性的、固定的低溫脅迫，因此SOD的變化趨勢有所不同，另一種情況可能是不同物種SOD對溫度脅迫的響應機制不同。雖然T處理提高了溫度，但是隨著土壤含水量的逐漸降低，T處理產(chǎn)生了水分脅迫，SOD活性持續(xù)下降，活性氧與酶系統(tǒng)的平衡被打破與水分脅迫有關(guān)，水分脅迫下植物細胞受損加重。有研究指出，水分脅迫誘導的膜脂過氧化是體內(nèi)活性氧ROS積累量超過一定的閾值而引起的，膜磷脂分子的多聚不飽和酸(亞油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)的不飽和雙鍵容易遭受羥基自由基的攻擊發(fā)生過氧化鏈式循環(huán)反應[34]。本研究中取樣時間主要包含了日均溫高于10℃，低于10℃，低于0℃3個階段，在這5次取樣的時間中，CK處理組的SOD活性均存在顯著差異(P<0.05)，這表明結(jié)縷草SOD的響應機制對冬季脅迫是較為敏感的。

冬季脅迫下，CK處理的CAT活性呈連續(xù)顯著下降的趨勢(P<0.05)，表明結(jié)縷草CAT響應機制對冬季脅迫較為敏感，結(jié)縷草對H2O2的清除能力減弱，亦或因為過氧化氫的積累和清除的平衡被打破，研究者認為一定水平的過氧化氫可以作為信號分子，在植物對逆境脅迫響應過程中擔當重要角色，有助于植物啟動相關(guān)基因的表達，而過量的H2O2會導致過氧化作用，引起細胞膜受損，嚴重時細胞則死亡[37]。TW,W和T處理組CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而10月27日，CK處理CAT活性就已經(jīng)顯著高于其他處理組(P<0.05)，這可能是因為CK組較早接受了溫度和水分的復合脅迫，CAT已經(jīng)結(jié)束了前期增長的階段。T處理在11月1號出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)，而W處理上升不顯著，這表明在此期間，水分對結(jié)縷草CAT活性影響大于溫度。在11月1至11月12日，T處理的CAT活性顯著下降了2 674.43 U·g-1(P<0.05)，而W處理在此期間下降了1 271.63 U·g-1，這表明在此期間水分對CAT活性的影響大于溫度，可以確定的是TW在CAT活性在4種處理中其出現(xiàn)顯著升高或降低趨勢的時間最晚，到11月19日CAT活性顯著高于其他處理(P<0.05)，為3 424.09 U·g-1，因此，保溫澆水(TW)對結(jié)縷草CAT的響應有顯著的影響。

4 結(jié)論

保溫處理和澆水處理均能緩解冬季脅迫，保溫和澆水能減緩葉綠素分解速度，緩解冬季脅迫對結(jié)縷草細胞膜的損傷，推遲結(jié)縷草進入枯黃期?？傮w而言，在冬季脅迫的前期，水分因素在冬季脅迫中的發(fā)揮的作用大于溫度，冬季脅迫的后期，溫度的發(fā)揮的作用大于水分。保溫澆水處理對冬季脅迫的緩解效果最佳，能夠顯著推遲結(jié)縷草的枯黃期，起到保溫保綠的作用。