李思源，劉振兵

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特010100；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)鄂爾多斯臨床醫(yī)學(xué)院 鄂爾多斯市中心醫(yī)院

在全球范圍內(nèi)，急性心肌梗死的發(fā)病率和病死率居高不下，隨著治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，再灌注治療使得急性心肌梗死患者的病死率明顯下降。但再灌注后發(fā)生的氧化應(yīng)激（OS）會(huì)誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1］。MIRI 在臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)換中仍存在許多問(wèn)題［2］。探討OS 在MIRI 中的發(fā)生及作用機(jī)制，可為MIRI 的治療和開發(fā)相關(guān)藥物提供參考及思路。現(xiàn)將近年OS 在MIRI中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 OS在MIRI中的作用

正常生理情況下，體內(nèi)各種氧化劑和抗氧化防御系統(tǒng)之間存在相互作用，使得體內(nèi)氧化劑與抗氧化防御系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡中，心肌缺血再灌注過(guò)程中氧化劑產(chǎn)生過(guò)多導(dǎo)致其與抗氧化防御系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而造成氧化劑和抗氧化防御系統(tǒng)的不平衡，稱為 OS［3］，其主要是 ROS 形成與酶和非酶抗氧化劑之間不平衡的結(jié)果。OS 是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。OS 通常與細(xì)胞和亞細(xì)胞水平中ROS 或活性氮（RNS）含量升高有關(guān)，他們?cè)贛IRI過(guò)程中起重要作用，其中ROS 作用更加廣泛。ROS是一組短壽命的低相對(duì)分子質(zhì)量化合物，是由氧經(jīng)歷的各種反應(yīng)衍生而來(lái)，ROS包括超氧陰離子（O2·-）、羥基自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單態(tài)氧（O-）和次氯酸（HClO）［4］。ROS 被認(rèn)為是細(xì)胞代謝、增殖、分化、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和凋亡的重要介質(zhì)，生理狀態(tài)下，ROS維持在較低水平作為信號(hào)分子發(fā)揮作用。在病理生理?xiàng)l件下，ROS的主要來(lái)源包括MIRI過(guò)程中的線粒體呼吸電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶（XO）、NADPH 氧化酶系統(tǒng)、解偶聯(lián)的一氧化氮合酶（NOS）系統(tǒng)與其他酶原系統(tǒng)［5］。

2 MIRI中ROS的產(chǎn)生途徑

2.1 線粒體途徑 在MIRI 中OS 反應(yīng)主要由ROS介導(dǎo)，線粒體是ROS 的主要來(lái)源，而線粒體中呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ是構(gòu)成線粒體來(lái)源ROS 的重要部分之一［6］。線粒體負(fù)責(zé)細(xì)胞能量的產(chǎn)生，當(dāng)線粒體進(jìn)行氧化磷酸化被干擾時(shí)，會(huì)導(dǎo)致ROS 生成速率增強(qiáng)，這一過(guò)程不僅減少了細(xì)胞能量生成（減少ATP的產(chǎn)生），而且導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生傾向增大［7］。當(dāng)線粒體感知到細(xì)胞內(nèi)的OS會(huì)啟動(dòng)應(yīng)激信號(hào)的釋放，導(dǎo)致膜去極化、腺嘌呤核苷酸水平改變、ROS 產(chǎn)生、Ca2+超載和mPTP 開放。但在正常生理狀態(tài)下線粒體中存在多種抗氧化機(jī)制來(lái)抵消ROS 的作用，從而減少其對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)缺血器官血液供應(yīng)重新恢復(fù)時(shí)，氧氣大量涌入會(huì)加劇ROS 的產(chǎn)生，影響線粒體中呼吸鏈的正常運(yùn)作，并破壞膜成分中的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起細(xì)胞和組織的功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8］。

2.2 NADPH 氧化酶（NOX）途徑 NOX 是能調(diào)節(jié)ROS 產(chǎn)生的特殊功能酶，NOX 所產(chǎn)生的ROS 起第二信使的作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，其中NADPH 氧化酶 2（Nox2）和 NADPH 氧化酶 4（Nox4）亞型在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用。再灌注期間，當(dāng)O2重新灌注到缺血部位，會(huì)引起NOX的上調(diào)和激活，進(jìn)而產(chǎn)生ROS［9］。ROS可通過(guò)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步使NOX活化促使ROS的產(chǎn)生。

2.3 髓過(guò)氧化物酶（MPO）途徑 MPO 是一種中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞酶，通過(guò)產(chǎn)生次氯酸、自由基和RNS 來(lái)增強(qiáng)H2O2的反應(yīng)性。 髓過(guò)氧化物酶在中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)時(shí)，需血紅素作為輔助因子并從H2O2和氯離子的反應(yīng)中產(chǎn)生次氯酸。一氧化氮與氧或氧相關(guān)的反應(yīng)中間體（如超氧化物）相互作用能產(chǎn)生大量的 ROS和 RNS［10］。

2.4 其他產(chǎn)生途徑 在局部缺血期間，ATP被逐步分解為次黃嘌呤，次黃嘌呤在組織中積累，黃嘌呤脫氫酶通過(guò)蛋白水解機(jī)制轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，缺血組織中存在過(guò)量的必需底物次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶，但由于缺乏為反應(yīng)提供燃料的氧分子，次黃嘌呤氧化為黃嘌呤和尿酸的反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。再灌注時(shí)，該必需的底物突然重新提供給組織，從而加劇ROS的快速過(guò)量產(chǎn)生。缺血再灌注過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)H+、Ca2+的積累及線粒體膜電位的破壞亦導(dǎo)致ROS 的形成［11］。研究表明，殘留 O2的存在是缺血期間 ROS 生成的關(guān)鍵因素，由于電子漏出增多，線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)軗p被認(rèn)為有助于殘留O2向O2·-轉(zhuǎn)化。

3 MIRI過(guò)程中氧化應(yīng)激介導(dǎo)損傷的途徑

3.1 ROS 介導(dǎo)途徑 OS 是再灌注損傷的重要標(biāo)志，其通過(guò)產(chǎn)生ROS 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，甚至死亡。及時(shí)的再灌注對(duì)于減輕缺血性損傷和挽救可存活的心肌至關(guān)重要，但其可促進(jìn)心肌細(xì)胞的損傷。盡管ROS在缺血再灌注（I/R）中的確切作用仍不明確，但在I/R 細(xì)胞損傷的起始過(guò)程中得到認(rèn)可。過(guò)量的ROS在MIRI損傷中起重要作用，積累的ROS除激活應(yīng)激反應(yīng)的通路外，與膜磷脂脂肪酸反應(yīng)，會(huì)直接破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層，導(dǎo)致膜各組分比例失常，影響膜流動(dòng)性、細(xì)胞器、膜通透性、離子通道、膜結(jié)合酶等的生理功能，引起細(xì)胞不可逆損傷，并且脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)引起線粒體和肌膜的不穩(wěn)定使非特異性小分子進(jìn)入膜內(nèi)，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹和凋亡；還可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，并直接對(duì)DNA 造成損傷，特別是線粒體DNA，通過(guò)破壞核酸的核糖，干擾其復(fù)制，影響蛋白質(zhì)正確合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；甚至還能降解位于細(xì)胞間隙中的成分，通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致組織水腫，繼而影響物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞等功能［12］。這種非特異性損傷啟動(dòng)細(xì)胞因子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子α（TNF-α）的產(chǎn)生。過(guò)量的TNF-α表達(dá)和隨后的心肌細(xì)胞腫瘤壞死因子α1型受體刺激會(huì)導(dǎo)致收縮功能障礙、肥大、纖維化和細(xì)胞死亡［13］。

OS的嚴(yán)重后果之一還有mPTP的開放，mPTP主要維持線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，通常不被離子和蛋白質(zhì)滲透，對(duì)于維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。雖然短暫的mPTP 開放參與心臟保護(hù)，但長(zhǎng)期開放會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)中不可逆轉(zhuǎn)的變化和細(xì)胞死亡，這是由于促凋亡因子的釋放所致。缺血期間細(xì)胞的酸性環(huán)境會(huì)阻止mPTP 的開放和心肌細(xì)胞過(guò)度收縮，再灌注期間ROS 通過(guò)誘導(dǎo)mPTP 的開放，使線粒體腫脹、破裂并導(dǎo)致促凋亡因子釋放從而啟動(dòng)細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，ROS 還可誘導(dǎo)產(chǎn)生更多ROS進(jìn)一步加劇損傷［9］。

線粒體作為ROS 產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中有多種途徑產(chǎn)生ROS 進(jìn)而促進(jìn)氧化損傷，如硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）從細(xì)胞核穿梭到線粒體，硫氧還蛋白2（Trx2）在線粒體中調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生和線粒體凋亡信號(hào)通路。Trx2通過(guò)減少半胱氨酸氧化形成的二硫鍵來(lái)修復(fù)可逆的氧化蛋白損傷，硫氧還蛋白通過(guò)二硫鍵與Trx2 結(jié)合，抑制Trx2的還原功能。TXNIP與Trx2的相互作用促進(jìn)線粒體ROS 的產(chǎn)生，觸發(fā)線粒體凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致I/R 損傷。OS 會(huì)損害細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，從而促進(jìn)Ca2+離子和促凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡途徑。硫氧還蛋白互作蛋白介導(dǎo)這些生物過(guò)程，并通過(guò)其促氧化作用促進(jìn)組織的氧化損傷。

3.2 NO 途徑 在心肌缺血再灌注過(guò)程中，OS 過(guò)程存在不同途徑介導(dǎo)的氧化損傷，如超氧化物與一氧化氮（NO）快速反應(yīng)形成具有高度反應(yīng)性的中間體過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-）。隨著細(xì)胞內(nèi)酸化的增加，ONOO-變得更加質(zhì)子化，形成過(guò)氧亞硝酸（ONOOH），然后迅速轉(zhuǎn)化為二氧化氮（NO2）和·OH。ONOO-/ONOOH 成為強(qiáng)細(xì)胞毒性氧化劑，引起氧化損傷。過(guò)量的NO 還可通過(guò)多種途徑激活線粒體凋亡，從而誘導(dǎo)OS［14］。

4 MIRI中氧化應(yīng)激與其他途徑的相互作用

4.1 氧化應(yīng)激觸發(fā)促炎反應(yīng) ROS 不僅通過(guò)自身造成MIRI，還可通過(guò)促進(jìn)其他途徑引起MIRI。當(dāng)細(xì)胞暴露于高水平的ROS 時(shí)會(huì)觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和黏附分子的表達(dá)，如通過(guò)使核因子κB（NF-κB）激活，觸發(fā)促炎反應(yīng)，其特征是TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 水平升高，黏附分子（如VCAM-1 和ICAM-1）的表達(dá)增加，從而促進(jìn)OS［15］。炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生和黏附分子的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞（特別是嗜中性粒細(xì)胞）堵塞心臟毛細(xì)血管并使得毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹，從而阻礙毛細(xì)血管內(nèi)血液流動(dòng)，這對(duì)血管運(yùn)作起負(fù)性作用［19］。在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)后，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）被炎癥介質(zhì)激活，使iNOS 解偶聯(lián)成為引起心肌OS的主要貢獻(xiàn)者。

4.2 氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡 ROS 水平增加可使金屬蛋白酶和鈣蛋白酶的激活，有助于細(xì)胞膨脹和溶解。可使mPTP 開放且會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹和線粒體外膜破裂，從而有利于促凋亡因子的沉積和SMAC/Diablo從膜間間隙進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡［16］。線粒體誘發(fā)的細(xì)胞凋亡受Bcl-2家族蛋白的調(diào)控，位于線粒體外膜中，Bcl-2家族蛋白控制線粒體膜的通透性，然后調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C（Cyt c）的釋放。他們可在功能上分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。前者包括Bad、Bax、Bak、Bid、Bim、Puma 和BNIP3；而后者包含 Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL 和 BAG。在 Bcl-2 家族蛋白中，Bax 可在細(xì)胞核或線粒體（np53 或mp53）中被抑癌蛋白 p53 上調(diào)；而 Bcl-2 或 Bcl-xL 可阻斷 np53 或mp53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，當(dāng)p53的表達(dá)受到抑制時(shí)，心臟組織中的Bax和Caspase-3被下調(diào)［17］。Cyt c是一種信號(hào)分子，在細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中從線粒體釋放到胞質(zhì)中。在胞質(zhì)中，Cyt c 可結(jié)合并激活A(yù)paf-1和proCaspase-9，隨后導(dǎo)致Caspase-9激活，進(jìn)而促進(jìn)Caspase-3和Caspase-7的激活［18］。

4.3 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)鈣超載 OS 不僅可損傷線粒體，還可損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而促進(jìn)Ca2+和促凋亡蛋白釋放至細(xì)胞質(zhì)中，增強(qiáng)凋亡途徑。OS可能在誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載中發(fā)揮關(guān)鍵作用，過(guò)量ROS 觸發(fā)的線粒體OS 會(huì)加速線粒體功能失常，降低線粒體能量供應(yīng)，破壞鈣穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體鈣超載［19］。ROS可通過(guò)影響興奮—收縮耦合的核心蛋白，包括L-型鈣通道、鈉通道、鉀通道和鈉—鈣離子交換器，直接損害心肌細(xì)胞的電生理和收縮機(jī)制。 ROS 還可改變肌漿網(wǎng)Ca2+-SERCA 的活性，并降低肌絲鈣的敏感性。此外，ROS 通過(guò)影響參與能量代謝的蛋白質(zhì)的功能而導(dǎo)致能量不足。MIRI 導(dǎo)致ROS 的積累從而引起OS，對(duì)心肌造成不利影響：①ROS 增加嚴(yán)重影響心肌細(xì)胞的電生理。ROS 逆轉(zhuǎn)Na+/Ca2+交換器（NCX）的功能，導(dǎo)致Ca2+流入和Na+流出。ROS 還通過(guò)L-型鈣通道增加Ca2+的內(nèi)流。②過(guò)量的ROS 促進(jìn)RyR2活性，抑制肌漿網(wǎng)Ca2+-SERCA2 活性，導(dǎo)致鈣超載，降低肌絲鈣敏感性，最終導(dǎo)致收縮功能障礙［20］。

5 MIRI中減輕OS相關(guān)的機(jī)制及通路

在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞具有抗氧化防御系統(tǒng)，以防止ROS 造成損傷。通過(guò)抗氧化劑發(fā)揮作用的機(jī)制很多，如：①清除活性氧或其前體；②抑制ROS 的形成；③通過(guò)與金屬離子的結(jié)合減弱ROS 生成的催化作用；④增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化生成；⑤通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 減少細(xì)胞凋亡。當(dāng)組織處于缺血缺氧狀態(tài)時(shí)，氧自由基清除系統(tǒng)的功能會(huì)降低或消失，而其產(chǎn)生會(huì)增加［21］，因此可減輕OS。谷胱甘肽（GSH）是心臟中ROS 最重要的清除劑，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）可催化谷胱甘肽生成氧化谷胱甘肽（GSSG），將H2O2還原為H2O 或脂質(zhì)過(guò)氧化氫（ROOH）進(jìn)而生成穩(wěn)定的醇。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）與谷胱甘肽還原酶（GSSG-R）一起維持低的GSH水平，保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化物損傷［22］。超氧化物歧化酶（SOD）亦是清除ROS 的重要物質(zhì)，可將O2·-催化成細(xì)胞毒性較低的H2O2，最后被CAT 或GPx 系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為水和氧分子，其他清除劑還包括硫氧還蛋白、維生素C、維生素E 等，通過(guò)他們的共同作用將ROS 濃度嚴(yán)格控制在較低的穩(wěn)態(tài)水平［7］。但抗氧化劑在參與心臟病理生理過(guò)程中并不能識(shí)別特定來(lái)源的ROS，當(dāng)氧化劑濃度超過(guò)細(xì)胞的適應(yīng)能力時(shí)，細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷更嚴(yán)重的OS。線粒體在OS 過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路作為線粒體中充當(dāng)能量傳導(dǎo)作用的通路，在線粒體生物合成、能量代謝和OS 中起重要的調(diào)節(jié)作用。Tilianin 可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路來(lái)改善線粒體能量代謝并減輕 OS，從而保護(hù)心肌 IRI 中的線粒體［23］。研究表明，ANG Ⅱ通過(guò)核AT1Rs 促進(jìn)AT2R 信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括線粒體AT2Rs 和Mas 受體的保護(hù)機(jī)制。核ANG Ⅱ受體的刺激通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活子1α 的抗氧化活性增強(qiáng)線粒體生物活動(dòng)發(fā)生，并增加去乙?；富钚?，從而保護(hù)細(xì)胞免受 OS［24］。減輕 OS 的機(jī)制：增強(qiáng) eNOS 介導(dǎo)的 Keap1的亞硝基化，進(jìn)而上調(diào)核Nrf2 和與Nrf2 相關(guān)的抗氧化信號(hào)通路，從而減輕 OS［25］；通過(guò) cGMP-PKGI 的活化抑制 OS［26］；PI3K/Akt 信號(hào)的激活參與心臟 I/R 的保護(hù)，而OS 能通過(guò)影響PI3K/Akt 信號(hào)通路從而造成損害［27］。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）是一種異二聚體膜結(jié)合酶，通過(guò)水解和/或轉(zhuǎn)肽作用破壞γ-谷氨酰胺鍵，在細(xì)胞外還原型谷胱甘肽及其S-共軛物的代謝中發(fā)揮生理作用。GGT 抑制劑通過(guò)抑制GGT 活性和隨后的ROS 產(chǎn)生，對(duì)I/R 引起的心臟功能障礙發(fā)揮保護(hù)作用［28］。

綜上所述，OS 在MIRI 過(guò)程中起重要作用，其中ROS與OS密不可分。正常生理狀態(tài)下，抗氧化系統(tǒng)會(huì)將ROS 控制在較低水平，當(dāng)組織缺血缺氧后，伴隨抗氧化系統(tǒng)功能的降低或消失，ROS產(chǎn)生增加，使得ROS 對(duì)細(xì)胞造成損傷。線粒體是產(chǎn)生ROS 的主要來(lái)源之一，ROS 通過(guò)直接對(duì)蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)造成損傷，并損傷線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ROS 還可通過(guò)促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、炎性因子、促凋亡因子等釋放加強(qiáng)MIRI。