胡銀平,王瑞雪,李冰潁,曹攏財(cái),崔茂金

（河南科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

能源是當(dāng)今人類(lèi)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),當(dāng)今社會(huì)利用的主要能源是不可再生的化石能源（煤、石油和天然氣）.隨著當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,日益增長(zhǎng)的能源需求與日益枯竭的不可再生能源的矛盾日益突出,同時(shí)化石能源的開(kāi)發(fā)和利用造成的環(huán)境破壞與環(huán)境污染等問(wèn)題逐漸突出,預(yù)計(jì)到2030 年,全世界二氧化碳的排放量將是1990 年的兩倍多[1],因此可再生能源的開(kāi)發(fā)和利用成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).含量豐富、來(lái)源廣泛、廉價(jià)易得、可再生的生物質(zhì)資源是化石能源的替代品之一[2-3].農(nóng)業(yè)生物質(zhì)資源如麥稈、稻稈、玉米秸稈等主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,可以通過(guò)預(yù)處理、糖化和發(fā)酵轉(zhuǎn)化為清潔能源乙醇、氫氣、生物柴油等[4-5].

將農(nóng)業(yè)生物質(zhì)通過(guò)糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物再利用的一種重要方法.糖化發(fā)酵的反應(yīng)速度主要取決于酶解反應(yīng)速度,而纖維素酶的鈍化是瓶頸,減少纖維素酶的失活和提高纖維素酶的穩(wěn)定性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一.農(nóng)業(yè)生物質(zhì)中木質(zhì)素的存在是影響其糖化發(fā)酵效率的關(guān)鍵因素之一.木質(zhì)素對(duì)纖維素酶解副作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）阻礙纖維素吸附纖維素酶；（2）通過(guò)疏水相互作用、靜電引力和氫鍵相互作用不可逆地吸附纖維素酶[6-7].為了降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶解的副作用,可以在酶解時(shí)添加非離子表面活性劑,由于非離子表面活性劑的疏水部分可以通過(guò)疏水的相互作用和底物中殘留的木質(zhì)素結(jié)合,從而阻止木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附[8-10].糖化發(fā)酵時(shí)添加非離子表面活性劑能阻止木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附,從而提高糖化發(fā)酵的速度和得率,減少價(jià)格昂貴纖維素酶用量.非離子表面活性劑如吐溫系列是多種酶的激活劑,對(duì)酶活性的保護(hù)和增效具有特殊的作用.非離子表面活性劑能是酶在木質(zhì)纖維素表面的吸附從90%降低到80%,并且能提高纖維素酶的穩(wěn)定性[11].

研究將非離子表面活劑吐溫80 添加到麥稈中提取纖維素,并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了酵母接種量、酶質(zhì)量濃度、非離子表面活性劑濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)同步糖化發(fā)酵影響.該研究將為農(nóng)業(yè)生物質(zhì)的高效利用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：麥稈于2019 年5 月收集于河南省新鄉(xiāng)市郊區(qū),自然晾干、粉碎、過(guò)50 目篩后于105 ℃下干燥至恒質(zhì)量,備用.

試劑：吐溫80 購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；纖維素酶購(gòu)于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母購(gòu)于安琪酵母股份有限公司.其他試劑均為分析純.

儀器設(shè)備：FY-SXT-02 索氏提取器,杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JY-6A 恒溫?cái)嚢栌驮″?常州金壇良友儀器有限公司；FA1004 型分析天平,天津天有利科技有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱,鞏義市英峪予華儀器T；FZ102 型植物粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司；WFJ7200 型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海雙旭電子有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器,鞏義市英峪予華儀器廠；DF-101S 型數(shù)顯集熱式磁力攪拌器,鞏義市英峪予華儀器廠.

1.2 麥稈中纖維素的提取

麥稈中纖維素的提取方法按照文獻(xiàn)[12]方法提取.

1.3 同步糖化發(fā)酵

稱(chēng)取1 g 干燥的麥稈于三角瓶中,加入一定量的吐溫80,在36 ℃水浴恒溫振蕩器放置30 min.然后分別加入濃度0.1 mol/L、pH 值為4.8 的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液配制的不同濃度的纖維素酶和5 mL 不同接種量的葡萄糖活化的酵母（固液比為1∶50）,將三角瓶放入36 ℃水浴恒溫振蕩器中同步糖化發(fā)酵不同時(shí)間,振蕩速度為100 r/min,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)乙醇含量.每組試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值.乙醇含量的測(cè)定采用重鉻酸鉀法[13]進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶質(zhì)量濃度影響 酶質(zhì)量濃度是影響同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的一個(gè)重要因素.在發(fā)酵溫度36 ℃、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L、發(fā)酵時(shí)間3 d 和酵母接種量為0.1%下研究了酶質(zhì)量濃度對(duì)麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖1 所示.

從圖1 可以看出,隨著酶質(zhì)量濃度的增大,乙醇的含量先增加,當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 g/L 時(shí)再繼續(xù)增加,乙醇含量增加趨于平緩.這是由于酶質(zhì)量濃度較小時(shí),產(chǎn)乙醇的效率較低；酶質(zhì)量濃度較大時(shí),由于酶的價(jià)格較高,生產(chǎn)成本相應(yīng)增大,所以選擇酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L 進(jìn)行的單因素試驗(yàn).

2.1.2 吐溫80 質(zhì)量濃度影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、發(fā)酵時(shí)間3 d 和酵母接種量為0.1%下研究了吐溫80 質(zhì)量濃度對(duì)麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖2 所示.

圖2 Tween 80 質(zhì)量濃度對(duì)乙醇含量影響Fig. 2 Effect of Tween 80 mass concentration on ethanol content

從圖2 可以看出,隨著吐溫80 質(zhì)量濃度的增大,乙醇的含量先增加,當(dāng)吐溫80 質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)再繼續(xù)增大,乙醇含量增加趨于平緩,這是由于非離子表面活性劑濃度較小時(shí),不能有效地阻止木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低.非離子表面活性劑濃度較大時(shí),過(guò)量的非離子表面活性劑對(duì)阻止木質(zhì)素吸附纖維素酶沒(méi)有作用,反而增加了生產(chǎn)成本,所以選擇吐溫80 質(zhì)量濃度為0.5 g/L進(jìn)行單因素試驗(yàn).

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度0.5 g/L 和酵母接種量為0.1%下研究了發(fā)酵時(shí)間對(duì)麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖3 所示.

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇含量影響Fig. 3 Effect of fermentation time on ethanol content

從圖3 可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乙醇的含量先增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h 時(shí)再繼續(xù)延長(zhǎng),乙醇含量增加趨于平緩.這是由于發(fā)酵時(shí)間較短時(shí),酵母不能完全利用糖化后的糖進(jìn)行發(fā)酵從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低；發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)時(shí), 酵母已經(jīng)完全利用糖化產(chǎn)生的糖產(chǎn)乙醇從而使得產(chǎn)乙醇的效率不在提高,而發(fā)酵時(shí)能源消耗會(huì)使生產(chǎn)成本較高,所以選擇發(fā)酵時(shí)間為96 h 進(jìn)行單因素試驗(yàn).

2.1.4 酵母接種量影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度0.5 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為96 h 下研究了酵母接種量對(duì)麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖4 所示.

圖4 酵母接種量對(duì)乙醇含量影響Fig. 4 Effect of yeast amount on ethanol content

從圖4 可以看出,隨著酵母接種量的增加,乙醇的含量先增加后減少,當(dāng)酵母接種量為0.1%時(shí),乙醇的含量最大.這是由于酵母接種量較少時(shí),酵母不能有效地利用糖化后的糖進(jìn)行發(fā)酵從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低；酵母接種量較多時(shí),過(guò)量的酵母不但不能提高產(chǎn)乙醇的效率增大生產(chǎn)成本,而且可能會(huì)對(duì)糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇產(chǎn)生抑制作用.

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步研究麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵工藝條件,選擇了酵母接種量（A）、酶質(zhì)量濃度（B）、吐溫80 質(zhì)量濃度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）四個(gè)因素,每個(gè)因素下選擇了三個(gè)水平,設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1 所示.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 1 Orthogonal experiment design and results

從表1 可以看出,當(dāng)同步糖化發(fā)酵方案為A1B3C3D3（酵母接種量為0.1%、酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為4 d）時(shí)乙醇質(zhì)量濃度含量最高,為27.35 g/L.從表1 中的極差分析可以看出,四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋好纲|(zhì)量濃度（B）＞吐溫80 質(zhì)量濃度（C）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞酵母接種量（A）,吐溫80 對(duì)麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵方案為A1B3C3D2（酵母接種量為0.1%、酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為3 d）,此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度為27.99 g/L.表1 中乙醇含量最大值比通過(guò)極差得出的最佳條件下的乙醇含量略低,這是由于這兩個(gè)條件除了發(fā)酵時(shí)間不同外,其他三個(gè)條件完全相同,發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng),發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇增加不大,同時(shí)乙醇容易揮發(fā),乙醇含量下降.最佳條件下加非離子表面活性劑吐溫80 比未加吐溫80 乙醇含量提高了5.22%,說(shuō)明非離子表面活性劑吐溫80 對(duì)麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇有促進(jìn)作用.

對(duì)表1 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 正交試驗(yàn)方差分析Tab. 2 Variance analysis of orthogonal experiment

從表2 中的方差分析可以看出,四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性順序?yàn)槊纲|(zhì)量濃度（B）、吐溫80質(zhì)量濃度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）、酵母接種量（A）,這與表1 中的極差分析結(jié)果得出的主次順序是一致的.酶質(zhì)量濃度（B）的F＞F0.05,說(shuō)明其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著；其他三個(gè)因素的F＜F0.1,說(shuō)明其他三個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均不顯著.

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化了麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵的條件.得出如下結(jié)論：（1）單因素試驗(yàn)研究結(jié)果表明乙醇含量隨著酶質(zhì)量濃度、吐溫80 質(zhì)量和發(fā)酵時(shí)間的增加先增大后逐漸趨于平緩,而隨著酵母接種量的增加先增大后減小.（2）正交試驗(yàn)研究結(jié)果表明四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)槊纲|(zhì)量濃度、吐溫80 質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、酵母接種量.吐溫80 對(duì)麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵條件為酵母接種量0.1%、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L和發(fā)酵時(shí)間3 d,此時(shí)乙醇含量為27.99 g/L.最佳條件下添加非離子表面活性劑吐溫80 使乙醇含量提高了5.22%,說(shuō)明非離子表面活性劑吐溫80 對(duì)麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇有促進(jìn)作用.