申成凱，趙海軍，孫代同，呂成昱，趙希春

1青島市膠州中心醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科，山東 青島 266300；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以進行性關(guān)節(jié)疼痛、畸形及其功能障礙、關(guān)節(jié)軟骨破壞等為特征的關(guān)節(jié)疾病。OA的發(fā)生是多種危險因素共同參與的復(fù)雜過程，包括遺傳因素、炎癥、激素、年齡、肥胖、生活習(xí)慣等。流行病學(xué)調(diào)查顯示，OA發(fā)生不但與環(huán)境及體內(nèi)炎性因子的參與有關(guān)，還與種族的遺傳差異相關(guān)［1］。研究［2］證實，OA發(fā)生存在相關(guān)的易感基因，而且有較強的遺傳傾向。白細胞介素-1β（IL-1β）的表達與種族遺傳有關(guān)已被國內(nèi)外很多研究證實，其基因位點的多態(tài)性在不同的種族呈現(xiàn)不同的分布頻率。IL-1β是前炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)過程中起重要作用，通過其調(diào)控基因白細胞介素-1B（IL-1B）基因多態(tài)性影響IL-1β相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，使IL-1β在體內(nèi)的水平發(fā)生改變，從而改變OA的發(fā)生率［3］，而體內(nèi)IL-1活性在很大程度上取決于白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1ra）的調(diào)控。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，白細胞介素-1受體拮抗劑等位基因2（IL-1RN*2）與許多慢性炎癥及自身免疫疾病相關(guān)，推測可能與攜帶者體內(nèi)IL-1ra水平發(fā)生錯誤表達有關(guān)［4］。本研究通過分析IL-1RN*2串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與膠東地區(qū)原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（PKOA）患者易感性的關(guān)系，探索IL-1RN基因在PKOA發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年3月—2021年3月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬膠州中心醫(yī)院收治的PKOA患者244例（觀察組），男58例，女186例；年齡52～74（58.38±5.65）歲；BMI 20.32～29.46（26.57±3.24）kg/m2。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合美國風(fēng)濕病學(xué)會PKOA診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①近1個月大多數(shù)時間膝關(guān)節(jié)疼痛；②X線片的Kellgren/Lawrence評分［6］>Ⅱ級；③膝關(guān)節(jié)晨僵≤30 min；④有骨摩擦音或膝關(guān)節(jié)骨性膨大。排除標(biāo)準(zhǔn)：①BMI≥30 kg/m2；②既往有膝關(guān)節(jié)外傷、手術(shù)史造成的創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎；③既往有膝關(guān)節(jié)慢性感染、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病等病史；④實驗室檢查CRP、血沉高于正常的3倍。另選233例健康查體者作對照（對照組），男54例，女179例；年齡45～65（55.70±13.5）歲；BMI 18.02～29.08（25.32±1.29）kg/m2；X線檢查證實無PKOA表現(xiàn)。消除人群研究中的地域及種族影響，所有的研究對象均來自于膠東地區(qū)漢族人群。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。本研究經(jīng)青島市膠州中心醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可，所有受試對象均簽署實驗知情同意書。

1.2 IL-1RN基因多態(tài)性分析 使用非離心柱型血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒（TIANGEN BIO‐TECH），通過EDTA抗凝的外周血白細胞中提取所有研究對象的DNA。IL-1RN基因多態(tài)性表現(xiàn)為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR），其重復(fù)序列長為86 bp，人類可有5種不同的重復(fù)組合等位基因，分別是：2個重復(fù)體IL-1RN*2，240 bp；3個重復(fù)體ILIRN*4，325 bp；4個重復(fù)體IL-1RN*1，410 bp：5個重復(fù)體IL-1 RN*3，500 bp和6個重復(fù)體IL-1 RN*5，595 bp；其中3、5、6重復(fù)體的發(fā)生率極低。IL-1RN VNTR［7］：5’CTCAGCAACACTCCTAT3’，5’TCCTG‐GTCTGCAGGTAA3’。PCR擴增條件：94℃先預(yù)變性5 min，然后按97℃變性10 s，58℃退火30 s，70℃延伸35 s，33個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過2.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳100 min后，在紫外燈下根據(jù)電泳結(jié)果對研究對象行基因型分類。IL-1RN是插入/缺失基因多態(tài)性，擴增PCR產(chǎn)物片段長度可變，本實驗中根據(jù)串聯(lián)重復(fù)不同分割成為240、325、410、500 bp的4個片段，形成4種基因型，電泳結(jié)果中只有410 bp片段的為1/1基因型，電泳結(jié)果中只有240 bp片段的為2/2基因型，電泳結(jié)果同時出現(xiàn)410 bp和240 bp兩條片段的為1/2基因型，電泳結(jié)果同時出現(xiàn)410 bp和325 bp兩條片段的1/4基因型。在我們的研究對象中1/1基因型的數(shù)量最多，所以將1/1基因型定位野生型（未突變型），在國外的研究中發(fā)現(xiàn)IL-1RN*2基因與很多疾病的易感性相關(guān)，故將含有2個重復(fù)體IL-1RN*2基因作為變異型（突變型）來研究。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件和Hap‐loview軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。用Haplo‐view軟件對不同基因型頻率分布特征進行哈代－溫伯格平衡檢驗，分析基因型分布是否符合遺傳平衡定律。用非條件Logistic回歸分析兩組之間的單核苷酸位點基因型出現(xiàn)頻率的分布，通過計算各個基因型的比值比（OR）、95%可信區(qū)間（CI）和P值，來評估哪種基因發(fā)生PKOA的風(fēng)險高。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡定律分析結(jié)果 基因型數(shù)目的觀察值與該位點上全部基因型頻率分布在符合Hardy-Weinberg平衡時的期望值之間的吻合程度，該研究觀察組和對照組在IL-1RN的基因型分布的觀察值和期望值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），研究對象的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 IL-1RN的基因多態(tài)性分析結(jié)果 通過聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性方法（PCR-RFLR）在我們所有的研究對象中一共發(fā)現(xiàn)3種等位基因和4種基因型，其中1/1基因型僅有一條410 bp的片段，1/2型 為410 bp和240 bp兩條片段，1/4型為410 bp和325 bp兩條片段，2/2型為一條240 bp的片段。

2.3 兩組IL-1RN基因型、等位基因頻率比較 觀察組基因型1/1 176例（72.1%）、1/2 53例（21.7%）、2/2 12例（4.90%）、1/4 3例（1.30%），對照組分別為169例（72.5%）、50例（21.5%）、10例（4.30%）、4例（1.70%），兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。觀察組等位基因1：408例（83.6%）、等位基因2：77例（15.8%）、等位基因4：3例（0.6%），對照組分別為392例（84.1%）、70例（15.0%）、4例（0.9%），兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。風(fēng)險性非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，IL-1RN基因變異型（1/2和2/2）發(fā)生PKOA的風(fēng)險是非變異基因型（1/1+1/3+1/4）的1.955倍（OR=1.955，95%CI=0.635～5.437）；其中攜帶變異IL-1RN*2基因位點發(fā)生PKOA的風(fēng)險是IL-1RN*1基因位點的1.589倍（OR=1.589，95%CI=0.791～3.016）。

3 討論

OA是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，主要發(fā)生在中老年患者。最近實驗表明，OA是一種主要影響大的負重關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，如髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)［8］。OA病理過程包括關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨磨損，以及異常的重塑導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙［9］。文獻［10-12］報道，年齡、性別（女性居多）、肥胖、營養(yǎng)不良、關(guān)節(jié)嚴(yán)重損傷、關(guān)節(jié)力線改變、基因遺傳因素也對OA的發(fā)病起主要決定因素。然而研究［13］表明，膝關(guān)節(jié)OA不是一種單純的老化過程，而是遺傳度較高的疾病。

IL-1β是PKOA遺傳因素研究的熱門致炎因子之一，其調(diào)控基因IL-1B的基因多態(tài)性與PKOA之間的相關(guān)性研究缺乏統(tǒng)一的結(jié)論，先前我們研究了一些IL-1B基因與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PKOA的易感與IL-1B基因的某些位點多態(tài)性相關(guān)。KAARVATN等［14］通過對兔骨性關(guān)節(jié)炎模型的研究，發(fā)現(xiàn)IL-1β細胞因子的過度表達破壞兔的關(guān)節(jié)組織，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，但通過IL-1β抑制劑靶向結(jié)合IL-1受體，可抑制IL-1β的作用，降低軟骨基質(zhì)降解，阻止軟骨細胞被破壞，故認(rèn)為IL-1β很可能在OA發(fā)病過程中過度表達，從而提出了該細胞因子可作為臨床早期診斷膝關(guān)節(jié)OA的一項指標(biāo)［15］。IL-1ra能抑制IL-1β發(fā)揮作用，從而保護軟骨細胞，減輕臨床癥狀的作用，而IL-1ra/IL-1β的比率失衡與軟骨破壞程度相符，是PKOA形成的關(guān)鍵因素［16］。在膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病過程中，各細胞因子間是相互作用、相互調(diào)節(jié)的，細胞因子對OA的影響是一個非常復(fù)雜的過程，細胞因子基因多態(tài)性的不定向表達，影響其在關(guān)節(jié)液中的濃度，進而影響軟骨細胞的代謝，造成PKOA發(fā)生概率發(fā)生變化。研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，IL-RN攜帶兩種不同的基因位點多態(tài)性對KOA有保護作用。

在我們之前研究中發(fā)現(xiàn)PKOA患者血清IL-1β水平明顯高于正常人水平。TOWNE等［19］發(fā)現(xiàn)，IL-1β水平與PKOA軟骨的破壞程度呈顯著正相關(guān)，IL-1β水平的高低可影響PKOA的進展過程。鮑亮教授也得出同樣的結(jié)論，提出關(guān)節(jié)液與血清中的IL-1β水平的可間接反映KOA的疾病嚴(yán)重程度，由此可見血清IL-1β的水平與PKOA的發(fā)生具有一定的相關(guān)性。由于PKOA的臨床檢查在時間上滯后于膝關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)展，所以早診斷、早治療對于PKOA的預(yù)防和治療意義尤為重要。既然IL-1ra可以通過競爭性的與IL-1受體結(jié)合抑制IL-1β發(fā)揮作用，是否IL-1ra的水平是也與PKOA的易感性相關(guān)。通過該實驗研究尋找IL-1RN（VNTR）的哪種基因型可對PKOA有保護作用，在本實驗中發(fā)現(xiàn)IL-1RN（VNTR）的四種基因型，未發(fā)現(xiàn)1/3基因型，1/1基因型占的比例最多，在觀察組176例（72.1%），在對照組169例（72.5%），變異基因型1/2和2/2在觀察組65例（26.6%），在對照組60例（25.8%）。IL-1RN基因變異型（1/2和2/2）發(fā)生膝關(guān)節(jié)OA的風(fēng)險系數(shù)是對照組的1.955倍，但是差異缺乏統(tǒng)計學(xué)意義。在基因位點分布中，變異等位基因2的研究對象為在觀察組77例（15.8%），在對照組為70例（15.0%），變異等位基因2發(fā)生PKOA的概率是野生等位基因1的1.589倍，差異仍然無統(tǒng)計數(shù)意義，該實驗結(jié)果顯示影響IL-1β血清水平的IL-1RN*2串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與膠東地區(qū)的PKOA的高發(fā)病率無明顯相關(guān)性。國內(nèi)外關(guān)于IL-1RN等位基因與PKOA的相關(guān)性研究比較少，而且結(jié)論不一，這可能與選擇樣本的地域差異、種族差異，診斷標(biāo)準(zhǔn)等原因相關(guān)，下一步需要我們收集更多的數(shù)據(jù)，更詳細的資料，得出更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

一項關(guān)于髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的OA病例對照研究的Meta分析指出，目前大量的研究只是增加了現(xiàn)有結(jié)論的不確定性，可能排除了一些低風(fēng)險關(guān)聯(lián)，但是在種群差異之間，共同的多態(tài)性這種情況可能很少見，也可能根本不存在［20］。OA是有多種炎性因子共同參與的一種復(fù)雜性疾病，任何一個細胞因子的等位基因變異都有可能對OA的形成產(chǎn)生影響，等位基因分布在多樣化的人群中，每個亞群體都擁有單一的或多個風(fēng)險因素，因此，PKOA的形成存在多種不確定的風(fēng)險因素，要評估PKOA易感性的遺傳因素，需要在盡可能多的人群中的尋找易感候選基因，同時還需排除影響PKOA發(fā)病機制的其他風(fēng)險因素。IL-1RN的基因多態(tài)性在PKOA發(fā)生過程中的未知的特異性影響，有待進一步的探究。由于PKOA的確切病因和發(fā)病機制仍不太清楚，因此對其治療仍難以達到理想的效果，目前國內(nèi)外都在為保膝積極尋找治療方案，假如我們能發(fā)現(xiàn)PKOA的遺傳易感基因，從而降低PFOA的發(fā)生率，這可能比探索膝關(guān)節(jié)OA的手術(shù)治療方案更有意義。

總之，PKOA患者體內(nèi)IL-1β炎性因子的血清水平明顯升高，但影響IL-1β血清水平的IL-1RN*2基因的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與膠東地區(qū)PKOA高發(fā)病率無明顯相關(guān)性。