王衡，滿海燕

（1.甘肅省武威市涼州區(qū)永昌鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)服務(wù)站，武威 733000；2.甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理站，武威 733000）

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的牛的一種以腹瀉、胃腸炎、消化道黏膜糜爛及壞死為主要特征的接觸性傳染病[1,2]，BVDV進(jìn)入機(jī)體后會破壞牛的自身免疫系統(tǒng)，使機(jī)體處于免疫耐受和持續(xù)感染狀態(tài)，導(dǎo)致免疫力下降，使病牛容易被致病菌侵襲而感染其他疾病[3,4]。由于牛群中BVDV持續(xù)感染的長期存在，只有通過流行病學(xué)監(jiān)測并逐步淘汰持續(xù)帶毒感染牛才能達(dá)到有效控制[5]。BVDV于1946年在美國紐約州被首次報道，隨后呈全球范圍內(nèi)流行，目前已有部分發(fā)達(dá)國家宣稱其已徹底消滅凈化了BVDV，我國于1980年在吉林省某奶牛場一頭突發(fā)高燒，腸道嚴(yán)重出血、糜爛和潰瘍的高產(chǎn)奶牛中首次分離到BVDV[6]。近年來，隨著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，國外引種以及各地區(qū)之間貿(mào)易交流的日益頻繁，BVDV傳播風(fēng)險逐步升高，BVDV感染已在一定程度上直接影響我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了掌握甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛群中BVDV的流行情況，有效保護(hù)甘肅省奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，本研究采用RT-PCR方法對2017-2019年采集于甘肅省武威市涼州區(qū)的690份奶牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的流行病學(xué)調(diào)查與分析。

1 材料與方法

1．1 檢測樣品來源

2017～2019年，采集于甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛不同養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶的奶牛新鮮糞便樣品共計690份，其中臨床中具有明顯腹瀉癥狀的腹瀉奶牛糞便樣品243份，臨床中沒有表現(xiàn)出腹瀉癥狀的牛只糞便樣品447份。

1．2 主要試劑

病毒基因組RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1．3 糞便樣品的處理與病毒基因組RNA的提取

將采集的新鮮糞便樣品溶解于5倍體積滅菌生理鹽水中，充分破碎、混合均勻后，以12 000r/min離心10min，吸取上清液0.2mL，利用病毒基因組RNA提取試劑盒依次提取690份糞便樣品的病毒基因組RNA。

1．4 引物設(shè)計與合成

參照參考文獻(xiàn)[7]的方法，設(shè)計1對BVDV特異性檢測引物，上游引物序列為：5’-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3’，下游引物序列為：5’-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3’，該引物預(yù)擴(kuò)增244bp的BVDV 5’端非編碼區(qū)基因保守序列。

1．5 RT-PCR擴(kuò)增與檢測

利用合成的BVDV特異性檢測引物分別對提取的690份糞便樣品病毒基因組RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增體系為：2×Buffer 10μL、BVDV上游和下游引物各0.5μL、酶0.5μL、RNA 3.0μL、水5.5μL；RT-PCR擴(kuò)增程序為：50℃ 30min；95℃3min；95℃ 20s，56℃ 20s，72℃ 20s，共35個循環(huán)；72℃ 8min。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μ L擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1．6 檢測結(jié)果的比較分析

將690份檢測樣品的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果依次進(jìn)行不同年份下腹瀉患牛糞便樣品和無腹瀉癥狀糞便樣品的比較分析，掌握甘肅省武威市涼州區(qū)2017～2019年腹瀉奶牛和健康奶牛BVDV的感染情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用RT-PCR方法對采集于甘肅省武威市涼州區(qū)的690份糞便樣品進(jìn)行了BVDV的病原學(xué)檢測，共檢測出BVDV陽性樣品114份，BVDV陰性樣品576份，部分樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

圖1 部分樣品RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．2 不同年份下總體樣品的檢測結(jié)果

表1為不同年份下690份奶牛糞便樣品的總體檢測結(jié)果。從表1可以看出，2017-2019年BVDV總體陽性感染率為16.52%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為12.50%、16.25%、19.77%，甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛群中BVDV的陽性感染率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。

表1 不同年份下總體樣品的檢測結(jié)果 單位：份,%

2．3 不同年份下腹瀉奶牛樣品的檢測結(jié)果

表2為不同年份下243份腹瀉奶牛糞便樣品的檢測結(jié)果。從表2可以看出，2017-2019年腹瀉奶牛中BVDV總體陽性感染率為35.80%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為28.57%、34.48%、41.94%，腹瀉奶牛中BVDV的陽性感染率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。

表2 不同年份下腹瀉奶牛樣品的檢測結(jié)果 單位：份,%

2．4 不同年份下健康奶牛樣品的檢測結(jié)果

表3為不同年份下447份無腹瀉癥狀奶牛糞便樣品的檢測結(jié)果。從表3可以看出，2017-2019年這些奶牛中BVDV總體陽性感染率為6.04%，其中2017年、2018年、2019年的陽性感染率分別為4.65%、5.88%、7.27%，無腹瀉癥狀奶牛BVDV的陽性感染率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。

表3 不同年份下無腹瀉癥狀奶牛樣品的檢測結(jié)果 單位：份,%

3 討論

BVDV一直是引起奶牛相關(guān)腹瀉性疾病的主要致病原之一，近年來隨著我國奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，BVDV在奶牛群中的流行也日漸擴(kuò)大，給我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大威脅，當(dāng)前我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)比較密集的地區(qū)均陸續(xù)報道了BVDV的感染。商云鵬等[8]采用RT-PCR方法對采集于東北地區(qū)19個規(guī)?；膛龅难鍢悠愤M(jìn)行了BVDV的病原學(xué)檢測，結(jié)果顯示有52.6%（10/19）的奶牛場檢測出BVDV核酸陽性，東北地區(qū)大部分奶牛場中存在BVDV感染，且存在BVDV持續(xù)性感染牛。張世勛等[9]采用RT-PCR方法對黑龍江省4個規(guī)?；膛觯ˋ～D場）奶牛耳組織樣品進(jìn)行了BVDV抗原檢測，結(jié)果A場、B場、C場、D場奶牛BVDV陽性率分別為0.5%（1/193）、0.2%（2/875）、1.8%（1/55）、0%（0/163），表明黑龍江省部分地區(qū)奶牛群中存在BVDV污染。張信軍等[10]采用巢式RT-PCR方法對江蘇省7個市和地區(qū)的13個大型規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的100份血清樣品進(jìn)行BVDV抗原檢測與基因分型，結(jié)果BVDV平均陽性感染率為55%（55/100），BVDV-Ⅰ型占11%（6/55），BVDV-Ⅱ型為78%（43/55），Ⅰ型與Ⅱ型混合感染占11%（6/55），表明BVDV在江蘇省主要規(guī)模奶牛場普遍流行，且大部分牛場均能檢測到BVDV持續(xù)感染牛。該BVDV感染的基因型包括基因Ⅰ型、Ⅱ型，但主要以Ⅱ型為主。本研究采用RT-PCR方法對2017～2019年采集于甘肅武威市涼州區(qū)的690份奶牛糞便樣品（腹瀉奶牛糞便樣品243份，無腹瀉癥狀奶牛糞便樣品447份）進(jìn)行了BVDV的病原學(xué)檢測與分析，BVDV總體陽性感染率為16.52%（114/690），腹瀉奶牛陽性感染率為35.80%（87/243），無腹瀉癥狀奶牛陽性感染率為6.04%（27/447）。以上不同地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查資料共同表明，包括甘肅省武威市涼州區(qū)在內(nèi)的我國奶牛養(yǎng)殖密集地區(qū)均存在BVDV的感染與流行，且不同地區(qū)的陽性感染率差異較大。同時，本次流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛群中BVDV的陽性感染率自2017-2019年有逐年升高的趨勢，雖然升高的幅度并不是很大，但仍存在BVDV流行逐漸嚴(yán)重的勢頭，應(yīng)引起足夠重視，需要加強(qiáng)奶牛群中BVDV的綜合防控工作。對于奶牛BVDV的綜合防控，應(yīng)采取以疫苗免疫接種為主，加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測，根據(jù)流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果逐步撲殺、淘汰陽性感染牛，早日實現(xiàn)奶牛群中BVDV的凈化。