熊 偉，趙 亮

(1.武漢市第一醫(yī)院(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)，湖北 武漢430022；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430014)

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是一種骨代謝性疾病，以骨微量結(jié)構(gòu)損傷、骨量、骨密度損失為主要特征，多發(fā)于老年人。隨著我國人口老齡化日益嚴(yán)重，OP發(fā)病率隨之上升，據(jù)預(yù)測，2020年我國將有近3億OP患者，約占世界的50%以上[1]。OP極易引發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折(Osteoporotic fracture，OPF)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。

杜仲為傳統(tǒng)中藥，歷史悠久，其主要功效為補(bǔ)腎陽、納氣、強(qiáng)筋骨，多用于肝腎不足、腰膝酸痛[2]。杜仲中含有的總黃酮可促進(jìn)骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白，可以有效改善OP患者癥狀。一定濃度的杜仲提取物能夠促進(jìn)骨細(xì)胞因子生長、抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)，達(dá)到防治OP的目的[3]。目前，西醫(yī)治療OP多使用骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑、骨礦化物三大類，療效有一定的局限性，且存在藥物不良反應(yīng)，因此，亟需尋求更有效且副作用小的治療方案。為此，本實(shí)驗(yàn)通過建立維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠模型，觀察骨密度、骨生長因子及相關(guān)細(xì)胞因子，探究鹽炙杜仲治療OP的療效，明確其抗骨質(zhì)疏松作用，為臨床新藥應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只(200±10 g/只)，3月齡，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：SCXK(鄂)2016-0005)，飼養(yǎng)環(huán)境為SD大鼠飼養(yǎng)SPF級屏障環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

鹽炙杜仲提取物(武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)基地提供，按照高、中、低劑量組給藥，生藥量分別換算為6、3、1.5 g·kg-1)；骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業(yè)有限公司購得，批號：國藥準(zhǔn)字Z20003255)；維甲酸(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度99.12%，批號081210)加純水配制成混懸液使用；0.5%CMC-Na(武漢谷歌生物有限公司)。

1.3 試劑及儀器

Prodigy型骨密度儀(GE，美國)；ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；ADVIA2400全自動生化分析儀(西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)；電子天平HZT型(北京實(shí)驗(yàn)儀器生產(chǎn)有限公司)；骨鈣素試劑盒(武漢英顥科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

將60只SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，觀察其身體狀態(tài)，按體質(zhì)量隨機(jī)分為六組：空白組、模型組、陽性對照組[骨疏康顆粒(5 g(生藥)/kg)]及杜仲高、中、低劑量組(6、3、1.5 g/kg；生藥)?？瞻捉M予以0.5%CMC-Na溶液，其他各組每日相同時(shí)段灌胃100 mg /kg維甲酸，連續(xù)14 d，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型[4]。

2.2 給藥方法

確定造模成功后，各組給予大鼠相應(yīng)藥物灌胃，1次/d，共4周。杜仲高劑量組給予6 g/kg劑量溶液灌胃；杜仲中劑量組給予3 g/kg劑量溶液灌胃；杜仲低劑量組給予1.5 g/kg劑量溶液灌胃；空白組和模型對照組給予等體積0.5% CMC-Na溶液灌胃。每周測量大鼠體質(zhì)量，以調(diào)整劑量。每日給藥體積1 mL/100 g。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 骨密度檢測 將大鼠麻醉后置于DEXA探頭下，固定四肢，脊椎呈中立位，采用雙能X射線密度儀對大鼠股骨骨痂BMD和BMC進(jìn)行檢測。

2.3.2 血清生化指標(biāo)檢測 藥物干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食24 h，次日每只大鼠按3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。取血清：經(jīng)心臟穿刺采血，以4 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離血清，收集上層血清，低溫保存。按ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測分析血清TNF-α、IL-6、E2、BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨痂BMD、BMC比較

與空白組相比，模型組大鼠股骨骨痂BMD、BMC數(shù)值顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠股骨骨痂BMD、BMC數(shù)值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，無明顯差異(P>0.05)，說明杜仲中、高劑量組和陽性對照組療效相當(dāng)。見表1。

表1 各組大鼠股骨BMD、BMC比較

3.2 各組大鼠骨生長因子比較

與空白組相比，模型組大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平比較 ((x±s，μg·L-1)

3.3 各組大鼠激素及細(xì)胞因子水平比較

與空白組相比，模型組大鼠血清E2水平顯著降低(P<0.05)，TNF-α及IL-6水平有所升高(P<0.05)；與模型組相比，杜仲中、高劑量大鼠血清TNF-α及IL-6水平顯著降低，E2水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清E2、TNF-α及IL-6水平比較

4 討論

OP屬于祖國醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇，基本病機(jī)為年老體衰、腎精虧虛，中醫(yī)認(rèn)為其治則當(dāng)是溫補(bǔ)腎陽、填精生髓兼以益氣養(yǎng)血。杜仲味甘、微辛，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝、堅(jiān)筋骨”的功效。近年來，通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽灸杜仲有很好的補(bǔ)腎健骨作用，本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠骨生長因子、激素及細(xì)胞因子水平變化情況探討鹽灸杜仲防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理，為中醫(yī)藥臨床治療骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)。

骨密度被WHO推薦為診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，在一定程度上能反映骨礦物含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組BMD、BMC水平較空白組明顯降低(P<0.05)，杜仲中、高劑量組大鼠股骨骨痂BMD、BMC較模型組也有顯著升高，與陽性對照組無明顯差異，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了鹽炙杜仲能有效提高骨質(zhì)量，改善全身骨密度，對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥有不錯(cuò)的療效。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)中的一組多功能細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞增殖分化成軟骨細(xì)胞，為骨折愈合的關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一。BMP-2在此過程中作用顯著，加速間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞。IGF-1參與成骨細(xì)胞生長、分化及代謝調(diào)節(jié)過程，能有效促進(jìn)骨細(xì)胞生成、刺激膠原合成從而促進(jìn)骨基質(zhì)形成[6]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能夠促進(jìn)骨組織內(nèi)血管網(wǎng)生成，直接作用于成骨細(xì)胞，增加骨細(xì)胞ALP活性，刺激成骨細(xì)胞分化、改善骨組織內(nèi)血供從而促進(jìn)骨形成。本研究結(jié)果顯示，治療后，與模型組相比，杜仲中、高劑量組大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平明顯升高(P<0.05)，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。這說明在鹽炙杜仲作用下，通過提高骨生長因子水平促進(jìn)血管內(nèi)皮生長，能有效防止骨質(zhì)疏松。

在骨代謝過程中，少不了雌激素的參與，它是保持骨質(zhì)量與骨結(jié)構(gòu)正常的必需激素，能影響成骨及破骨細(xì)胞活性、維持骨代謝平衡。有研究[7]表明，IL-6具有來源廣及作用途徑多的特點(diǎn)，主要通過調(diào)節(jié)破骨及成骨細(xì)胞來參與骨代謝過程，從而提高骨密度。TNF-α是重要的破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，通過炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)骨分解作用，還可通過促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用。IL-6、TNF-α的產(chǎn)生會促進(jìn)骨吸收、加重病情發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)治療后，杜仲中、高劑量組E2水平顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平顯著降低到正常值(P<0.05)，提示杜仲能通過促進(jìn)雌激素分泌及降低炎癥細(xì)胞因子水平對骨質(zhì)疏松大鼠模型產(chǎn)生治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，中、高劑量的鹽灸杜仲能促進(jìn)骨生長因子生成、影響炎癥細(xì)胞水平，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的，具有可行性。