李 曦，王曉曉，姚藝新，張培華，陳金佩，高姍姍

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都 611730；2.德陽市食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，四川 德陽 618000；3.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

川芎茶調(diào)散始載于《太平惠民和劑局方》，由川芎、羌活、白芷、防風(fēng)、細(xì)辛、薄荷、荊芥、甘草8味藥組成，主治外感風(fēng)邪所致的頭痛、惡寒、發(fā)熱、鼻塞[1]，是中醫(yī)臨床治療外感風(fēng)邪頭痛的經(jīng)典處方[2]。

無機(jī)元素具有多方面的功效，其具有極強(qiáng)的形成配合物的能力，易與生物體內(nèi)含氮、氧、硫的配體形成配位鍵，協(xié)調(diào)體內(nèi)物質(zhì)平衡，旦無機(jī)元素對藥效的發(fā)揮具有一定的協(xié)同作用[3-5]。目前研究表明，無機(jī)元素含量、種類能夠影響中藥的性味功效。在中藥復(fù)方中，性味功效不同的藥味中無機(jī)元素的種類和含量可能存在差異，而具有相似性味功效的藥味可能在無機(jī)元素的種類上有共性之處。作為功效發(fā)揮的基礎(chǔ)，無機(jī)元素含量的差異可能導(dǎo)致功效的強(qiáng)弱[6-8]。

根據(jù)中藥學(xué)的分類，在川芎茶調(diào)散的8味組成藥中，有7味解表藥(祛風(fēng)止痛)，1味補(bǔ)益藥(調(diào)和諸藥)，說明在無機(jī)元素組成方面可能存在差異，而功效相似的藥味可能存在共有的功效無機(jī)元素。川芎茶調(diào)散是不同藥味粉末的混合，未經(jīng)過提取等工藝，藥味的功效與復(fù)方的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。

目前尚未有川芎茶調(diào)散無機(jī)元素的研究。為此，本研究從川芎茶調(diào)散8味組成藥出發(fā)，建立測定其中15種無機(jī)元素含量的ICP-MS法，研究川芎茶調(diào)散8味組成藥的無機(jī)元素特征圖譜，分析川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷與甘草之間15種無機(jī)元素的差異，結(jié)合主成分分析篩選川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷發(fā)揮祛風(fēng)止痛功效的共有功效無機(jī)元素，明確不同藥味共有功效無機(jī)元素之間的差異，以期為川芎茶調(diào)散的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

CEM MARS6型微波消解儀(德國 Berghof公司)；7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，美國安捷倫公司)；BAS2245型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；DHG-9013A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒儀器有限公司)；Milli-Q型超純水機(jī)(Millipore Bedford MA，美國)。

SPEXertificate 15種標(biāo)準(zhǔn)溶液包含B、Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Cd、Ba(批號2-192AB，美國SPEX公司)，質(zhì)量濃度1 000 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液：73Ge(批號 GSB 04-1728-2004)、115In(批號 GSB04-1731-2004)、209Bi(批號 GSB 04-1719-2004)的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，購于中國計(jì)量科學(xué)研究院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；濃硝酸為MOS級(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

40份樣品分別由四川省成都市荷花池中藥材市場、廣東省普寧市中藥材市場收集，樣品來源信息詳見表1。樣品由康美藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量管理部劉茂貴主任藥師分別鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang的干燥根莖，傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的干燥根，馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根和根莖，唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBriq.的干燥地上部分，傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

取樣品粉末 0.2 g(80目)，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解罐中，放入通風(fēng)櫥，加入濃硝酸 8 mL，放置過夜。第2天放入微波消解儀中，按設(shè)定的消解程序處理：先經(jīng) 10 min由室溫升溫至 130 ℃，并維持 5 min消解，然后10 min內(nèi)由130 ℃升溫至165 ℃，并維持10 min消解，然后15 min內(nèi)由 165 ℃升溫至180 ℃，并維持 30 min消解。消解完畢后，冷卻至室溫，取出消解罐，在通風(fēng)櫥中將酸揮盡，加去離子水定容至 50 mL。同步以濃硝酸 8 mL不加樣品做空白試驗(yàn)。

表1 川芎茶調(diào)散8味組成藥的樣品信息

2.2 測定條件的優(yōu)化

儀器自動(dòng)調(diào)諧設(shè)定工作參數(shù)，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)對儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。測定條件：等離子射頻功率：1 550 W，等離子氣體：15 L/min，輔助氣體流量： 1 L/min，霧化氣流量：1 L/min，補(bǔ)償/稀釋氣體：1 L/min，霧化室溫度：2 ℃，蠕動(dòng)泵速度：0.3 rps。積分時(shí)間：1 s，延遲時(shí)間：1 s，重復(fù)次數(shù)：3次。測量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法，讀數(shù)方式：峰強(qiáng)。以73Ge、115In、209Bi為內(nèi)標(biāo)，監(jiān)測信號的變動(dòng)情況，能有效克服儀器信號的漂移和校正基體效應(yīng)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，用10%HNO3作空白溶液，將母液稀釋成 5、10、20、50、100 μg/mL。

根據(jù)試樣中待測元素的水平配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測定15種無機(jī)元素的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入73Ge、115In、209Bi內(nèi)標(biāo)溶液，同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)空白溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以待測元素分析峰信號值與內(nèi)標(biāo)元素參比峰響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果各元素在0～100 μg/L濃度范圍內(nèi)與比值線性良好，詳見表2。

表2 15種無機(jī)元素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和線性范圍

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次測定元素含量，15種無機(jī)元素的含量RSD值為0.45%～2.30%，表明儀器的精密性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一份含川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷、甘草樣品的待測溶液，分別于放置0、4、8、12、16、20、24 h后測定15種元素的含量，結(jié)果RSD值分別為0.65%～2.15%、0.62%～2.31%、0.59%～2.01%、0.76%～2.12%、0.76%～1.78%、0.68%～2.09%、0.76%～1.83%、0.78%～2.87%，表明待測溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果詳見表3。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取含川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷、甘草的樣品6份，制成供試品溶液，測定15種元素的含量，結(jié)果RSD值分別為0.45%～1.97%、0.89%～2.80%、1.07%～2.98%、0.98%～2.79%、0.99%～2.11%、1.28%～3.19%、1.39%～2.71%、0.78%～2.87%，說明方法的重復(fù)性良好，。結(jié)果詳見表3。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已測定含量的川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷、甘草樣品0.2 g，共6份，精確加入一定量的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再測定其含量，計(jì)算15種元素的回收率分別為95.98%～103.47%、95.89%～104.32%、95.64%～103.68%、95.69%～104.39%、95.34%～104.07%、95.33%～104.39%、95.38%～104.29%、95.39%～103.42%，RSD值分別為1.35%～3.99%、1.45%～3.29%、1.63%～3.28%、1.38%～3.56%、1.33%～2.89%、1.43%～3.98%、1.28%～4.01%、1.39%～3.78%，說明方法的回收率符合要求。結(jié)果詳見表3。

2.5 樣品的測定

按照 “2.1.1”項(xiàng)下方法制備川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷、甘草樣品的供試品溶液，在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，測定供試品溶液中15種無機(jī)元素的含量。40份樣品中15種無機(jī)元素的含量見表4。

表3 川芎茶調(diào)散8味組成藥的方法學(xué)考察 (%)

表4 川芎茶調(diào)散8味組成藥中15種無機(jī)元素的含量 (mg/kg)

續(xù)表4

3 結(jié)果與分析

3.1 8味組成藥中15種無機(jī)元素特征圖譜的建立

分別計(jì)算每個(gè)藥味每種無機(jī)元素的平均值和40份樣品中每種無機(jī)元素的平均值，再計(jì)算每個(gè)藥味每種無機(jī)元素的平均值與40份樣品中每種無機(jī)元素平均值的比值，繪制每個(gè)藥味15種無機(jī)元素折線圖作為特征圖譜?？梢钥闯?，不同藥味之間無機(jī)元素的特征圖譜差異較大，結(jié)果詳見圖1。

(a.川芎；b.羌活；c.白芷；d.細(xì)辛；e.荊芥；f.防風(fēng)；g.薄荷；h.甘草)

3.2 川芎茶調(diào)散8味組成藥的SIMCA-PCA分析

將40份樣品的結(jié)果代入SIMCA14.1軟件中進(jìn)行PCA-X分析。選擇前兩個(gè)主成分，R2X為0.412，Q2為0.15，得到Score Scatter 3D Plot圖，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，5份甘草樣品與其余7味藥的差異明顯，說明甘草與其余7味藥中15種無機(jī)元素差異大，這可能是由于甘草的功效與其余7味藥差異較大。剩余的7味藥中有相互交叉的現(xiàn)象，可能與這7味藥的相似功效-祛風(fēng)止痛有關(guān)。

3.3 川芎茶調(diào)散中祛風(fēng)止痛共有功效無機(jī)元素的分析

圖2 40份樣品的PCA Score Scatter 3D Plot

15種無機(jī)元素的貢獻(xiàn)率排在前3的是Mg、K、S，貢獻(xiàn)率分別為42.04%、38.66%、13.26%，其余依次為Al、Fe、Ca、Mn、B、Ba、Zn、Cu、As、Se、Cd、Na。其中Mg、K、S的累積貢獻(xiàn)率為94.32%，是15種無機(jī)元素的主要組成部分，說明川芎、羌活、白芷、細(xì)辛、荊芥、防風(fēng)、薄荷的主要共有無機(jī)元素為Mg、K、S。結(jié)果詳見表7。

表5 主成分分析解釋的總方差

表6 成分矩陣

外感風(fēng)寒的發(fā)病部位為肺。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，肺主皮毛，強(qiáng)調(diào)了肺與皮毛的關(guān)聯(lián)性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，風(fēng)寒乘虛犯肺大鼠毛發(fā)中Mg的含量較正常大鼠低，說明Mg與外感風(fēng)邪的病因病機(jī)息息相關(guān)[9]。偏頭痛患者血清中的Mg含量偏低，服用MgSO4能夠有效緩解偏頭痛，說明Mg能夠治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。同時(shí)MgSO4能夠作用于肺部，治療支氣管哮喘，說明Mg與祛風(fēng)止痛功效的相關(guān)性強(qiáng)[10-11]。S在體內(nèi)不是必需的元素，常與其他離子結(jié)合存在。MgSO4能夠有效緩解偏頭痛和治療支氣管哮喘，說明S有可能是以硫酸根的形式發(fā)揮治療效果，即Mg與S具有協(xié)同作用。K有助于神經(jīng)傳導(dǎo)功能的正常運(yùn)行，能夠協(xié)調(diào)機(jī)體的生理狀態(tài)，還有利于腦部供氧，說明K在緩解偏頭痛方面有可能具有協(xié)同作用[12]，Mg、K、S與祛風(fēng)止痛的功效息息相關(guān)。

表7 川芎茶調(diào)散7味組成藥中15種無機(jī)元素的相關(guān)系數(shù)、含量平均值、貢獻(xiàn)率

3.4 7個(gè)祛風(fēng)止痛藥味中Mg、K、S的差異性分析

在SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中，選擇單因素方差分析中的Student-Newman-Keuls，比較川芎茶調(diào)散7味組成藥中Mg、K的差異。在Student-Newman-Keuls的alpha=0.05的子集中，同一子集間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同子集間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K：川芎、細(xì)辛、羌活出現(xiàn)相互交叉的現(xiàn)象，無顯著性差異；荊芥、薄荷、白芷之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。荊芥、薄荷與防風(fēng)、細(xì)辛、白芷之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體含量順序?yàn)榍G芥>薄荷>防風(fēng)>川芎>羌活>細(xì)辛>白芷。Mg：7味藥之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體含量順序?yàn)榍蓟?薄荷>荊芥>川芎>防風(fēng)>細(xì)辛>白芷；S：具體含量順序?yàn)榍蓟?川芎>細(xì)辛>白芷>荊芥>薄荷>防風(fēng)。結(jié)果詳見表8。

表8 Student-Newman-Keulsa分析結(jié)果

4 討論

在40份樣品中，雖然5份川芎Cd含量在0.42～0.78 mg/kg之間，1份細(xì)辛的Cu含量為21.21 mg/kg，均不符合規(guī)定(Cd≤0.3 mg/kg，Cu≤20 mg/kg)[13]。但由于不同藥味在川芎茶調(diào)散中的用量比例不同(川芎16.33%，細(xì)辛4.08%)[1]，折合計(jì)算得川芎的Cd含量為0.08～0.13 mg/kg，細(xì)辛的Cu含量為0.87 mg/kg，符合限量要求。中藥是為中醫(yī)臨床服務(wù)的，而成方制劑是中藥在臨床上的最終應(yīng)用形式。中藥的質(zhì)量控制需要系統(tǒng)性地看待，不能僅僅停留在單味藥的質(zhì)量評價(jià)上。

川芎茶調(diào)散8個(gè)組成藥味中15種無機(jī)元素圖譜均不相同，特征性強(qiáng)。甘草與其余7味藥的15種無機(jī)元素差異明顯，說明可能與自身的藥性功效差異有關(guān)。川芎、荊芥、薄荷、羌活、白芷、細(xì)辛的相關(guān)功效無機(jī)元素為Mg、K、S，且不同藥味之間存在差異，很有可能是導(dǎo)致不同藥味在川芎茶調(diào)散中的功效既有相似性，又有區(qū)別性的原因。無機(jī)元素對于中藥功效發(fā)揮的作用是不可忽視的，需要結(jié)合臨床藥效研究進(jìn)一步闡明川芎茶調(diào)散的物質(zhì)基礎(chǔ)。