劉朝富，林益坤，譚亞利，袁應(yīng)化，廖文英

(解放軍海軍陸戰(zhàn)隊(duì)醫(yī)院，廣東 潮州)

0 引言

非小細(xì)胞肺癌(non-smallcell lung carcinoma，NSCLC)是臨床上最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，造成了巨大的衛(wèi)生及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。對(duì)NSCLC 的早期篩查診斷有助于提高根治性手術(shù)率，從而更好的改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)生存時(shí)間。血清無(wú)創(chuàng)腫瘤標(biāo)志物在NSCLC 的早期篩查診斷中有重要的應(yīng)用價(jià)值，便于針對(duì)高危人群進(jìn)行篩查評(píng)估。雖然目前也有如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化 酶(neuron-specific enolase，NSE)及細(xì)胞角蛋白19 可溶性片段(CYFRA21-1) 等的部分血清標(biāo)志物在臨床上得到了應(yīng)用，但是其針對(duì)NSCLC 的診斷準(zhǔn)確度仍有待提高。羧肽酶A4(carboxypeptidase A4，CPA-4) 屬于金屬羧肽酶家族，作為一種分泌性蛋白，其主要由細(xì)胞分泌后參與催化羧基端氨基酸的釋放，從而參與腫瘤相關(guān)微環(huán)境的形成[2]。既往的研究也報(bào)道了在如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤中存在CPA-4 的異常表達(dá)，但在NSCLC中的表達(dá)情況還相對(duì)較少[3-5]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9) 屬于B 類(lèi)明膠酶，其可以參與降解如明膠(I、Ⅱ、Ⅲ型)、彈力蛋白、層粘蛋白等，對(duì)多類(lèi)惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有重要的促進(jìn)作用[6]。因此，本研究檢測(cè)了初治NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9 的改變情況，并分析了兩項(xiàng)指標(biāo)的臨床診斷效能，以求為篩選腫瘤診斷標(biāo)志物提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

納入2018 年3 月至2020 年6 月在解放軍海軍陸戰(zhàn)隊(duì)醫(yī)院住院的初治NSCLC 患者79 名(NSCLC 組)，平均(45.59±8.72)歲，性別比(男/女)為59/20。同時(shí)納入健康對(duì)照56 名(健康對(duì)照組)，平均(43.70±8.46)歲，性別比(男/女)為43/13。NSCLC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國(guó)原發(fā)性肺癌診療指南[7]，所有患者在后期手術(shù)或組織活檢中經(jīng)病理檢查確診為NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非初治NSCLC；②孕婦及兒童；③缺少病理檢查結(jié)果。

1.2 一般情況及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查

所有NSCLC 患者在住院時(shí)記錄一般情況，包括性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(bodymassindex，BMI)、吸煙史、家族史等，同時(shí)完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及肺功能指標(biāo)。所有NSCLC 患者常規(guī)行胸片、CT 檢查，存在肺外器官轉(zhuǎn)移的患者均由PETCT 檢查確定。所有患者均由手術(shù)、支氣管鏡或胸腔穿刺活檢取得組織標(biāo)本并由病理檢查診斷為NSCLC?；颊叩腡NM 臨床分期根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)確定[8]。

1.3 血清CPA-4、MMP-9 的檢測(cè)

患者住院時(shí)采集外周血5mL，離心分離血清后分裝凍存于-20℃冰箱。檢測(cè)前將血清標(biāo)本取出在室溫下復(fù)融，使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)血清CPA-4 及MMP-9 水平。CPA-4 及MMP-9 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，檢測(cè)步驟按照試劑盒要求嚴(yán)格進(jìn)行，每個(gè)檢測(cè)樣品設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀(Thermo 公司生產(chǎn)的Multiskan FC 酶標(biāo)儀)檢測(cè)OD 值(檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為450nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品濃度，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 5.0 軟件繪制圖形。計(jì)量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用n(%)表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析使用Spearman 相關(guān)法，診斷價(jià)值分析使用ROC 曲線，曲線下面積(area under curve，AUC)≥0.750 提示診斷價(jià)值較高。P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平

患者一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平如表1 所示。與健康對(duì)照組相比，NSCLC 組血清CPA-4(4.50±1.23 vs.0.95±0.48ng/mL)、MMP-9(33.90±10.59 vs. 13.67±4.19ng/mL)及CEA(63.82±27.08 vs.15.15±6.88ng/mL)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.001)。不同性別、家族史及臨床分期NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9 水平如表2 所示。NSCLC 組中，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)患者血清CPA-4(4.98±1.28 vs.3.87±1.08，P=0.001) 及MMP-9(44.38±12.26vs.26.38±9.43，P＜0.001) 水平顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 一般情況、CPA-4、MMP-9 及CEA 水平

表2 NSCLC 患者亞組CPA-4、MMP-9 水平(n=79)

2.2 血清CPA-4(MMP-9)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

NSCLC患者CPA-4與腫瘤臨床分期(R=0.407，P＜0.001)、CEA(log10ng/mL)(R=0.477，P＜0.001)、MMP-9(R=0.338，P=0.002)呈顯著正相關(guān)，與年齡(R=0.152，P=0.246)、BMI(R=0.022，P=0.845) 無(wú)顯著相關(guān)性；MMP-9也與腫瘤臨床分期(R=0.469，P＜0.001)、CEA(log10ng/mL)(R=0.347，P=0.002) 呈顯著正相關(guān)，與年齡(R=0.053，P=0.642)、BMI(R=0.122，P=0.284)無(wú)顯著相關(guān)性。

2.3 CPA-4、MMP-9 及CEA 單獨(dú)或聯(lián)合診斷NSCLC的價(jià)值

血清CPA-4 水平單獨(dú)診斷NSCLC 的AUC 為0.829(95%CI：0.762～0.896)，當(dāng)cut-off 值取為2.86ng/mL 時(shí)，診斷特異度為0.767，靈敏度為0.810，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.829，陰性預(yù)測(cè)值為0.762，約登指數(shù)為0.577(圖1)。MMP-9 單獨(dú)診斷NSCLC 的AUC 為0.844(95%CI：0.777～0.912)，當(dāng)cut-off 值取為17.89ng/mL，診斷特異度為0.804，靈敏度為0.772，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.847，陰性預(yù)測(cè)值為0.714，約登指數(shù)為0.576(圖1)。CEA 診斷NSCLC 的AUC為0.812(95%CI：0.741～0.883)，當(dāng)cut-off值取為19.36ng/mL時(shí)，診斷特異度為0.750，靈敏度為0.722，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.811，陰性預(yù)測(cè)值為0.689，約登指數(shù)為0.472。CPA-4 聯(lián)合CEA 診斷NSCLC 的AUC 為0.872(95%CI：0.814～0.931)，MMP-9 聯(lián)合CEA 診斷NSCLC 的AUC 為0.879(95%CI：0.820～0.938)，CPA-4、MMP-9 及CEA 三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC 為0.903(95%CI：0.851～0.956)(圖2)。

3 討論

在我國(guó)，NSCLC 的臨床發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)[9]。NSCLC 作為發(fā)病率最高的惡性腫瘤，患者早期常無(wú)顯著的臨床表現(xiàn)及體征，確診時(shí)常已出現(xiàn)進(jìn)展或遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致NSCLC患者臨床預(yù)后較差，短期臨床病死率極高。對(duì)NSCLC 的早期篩查診斷，尤其是基于高危人群(高齡、吸煙、肺結(jié)核)的篩查有助于早期發(fā)現(xiàn)并給予根治性手術(shù)治療，從而最大限度的提高NSCLC 患者生存率，改善生活質(zhì)量。血清腫瘤標(biāo)志物作為一種無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，在NSCLC 的早期篩查診斷中有著重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)一些腫瘤標(biāo)志物還可以用于NSCLC預(yù)后及療效評(píng)估。臨床上目前常用的腫瘤標(biāo)志物包括CEA、NSE、CYFRA21-1 等，由于NSCLC 具有復(fù)雜的生物學(xué)特性，上述標(biāo)志物的診斷評(píng)估效能也需要加以改進(jìn)提高[10]。CPA-4及MMP-9 是參與惡性腫瘤微環(huán)境形成及影響腫瘤生物學(xué)特性的重要功能蛋白，探討兩項(xiàng)指標(biāo)在NSCLC 中的表達(dá)改變情況及臨床意義有助于篩選更為優(yōu)良的NSCLC 診斷評(píng)估指標(biāo)。

圖1 CEA、MMP-9 及CPA-4 單獨(dú)診斷NSCLC 的ROC 曲線

圖2 CEA、MMP-9 及CPA-4 聯(lián)合診斷NSCLC 的ROC 曲線

本研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者血清CPA-4 及MMP-9水平存在顯著的升高，且升高程度與TNM 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性。同時(shí)，血清CPA-4 單獨(dú)診斷NSCLC 具有較高的準(zhǔn)確度，而相關(guān)的研究方面，如Sun 等[11]的研究探討了CPA-4 用于NSCLC 患者(n=165)診斷及預(yù)后的臨床價(jià)值，結(jié)果顯示，NSCLC 患者腫瘤組織中普遍存在CPA-4 表達(dá)升高，且血清CPA-4 水平也存在著同步的升高。CPA-4 單獨(dú)診斷NSCLC 的AUC 可達(dá)0.781，特異度及靈敏度分別為0.70 及0.86。提示了CPA-4 用于NSCLC 診斷的重要臨床價(jià)值。在CPA-4 用于其他惡性腫瘤的診斷評(píng)估方面，如Sun 等[12]基于胃癌患者(n=100)的研究也顯示，胃癌患者腫瘤組織中存在CPA-4 的表達(dá)升高，且CPA-4 表達(dá)程度與腫瘤提及、分期、淋巴結(jié)侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性，高CPA-4 表達(dá)的患者遠(yuǎn)期預(yù)后更差(P＜0.001)，Cox 分析顯示CPA-4 是胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=1.965，95% CI：1.072～3.600，P=0.029)。在基于胰腺癌患者的研究中也發(fā)現(xiàn)，CPA-4 可以作為胰腺癌的診斷評(píng)估指標(biāo)，胰腺癌患者血清CPA-4 水平顯著高于健康對(duì)照，且CPA-4 水平與TNM 分期、淋巴結(jié)侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在顯著正相關(guān)，CPA-4 診斷胰腺癌的AUC 可達(dá)0.783，診斷特異度及敏感度分別為0.90 及0.61[13]。

另一方面，研究結(jié)果也顯示了血清MMP-9 在診斷NSCLC時(shí)也具有較高的診斷價(jià)值。相關(guān)的研究方面，如Gong 等[14]完成的薈萃分析顯示，NSCLC 患者血清MMP-9 水平與腫瘤體積(RR=0.83)、臨床分期(RR=0.72) 及不良預(yù)后(RR=1.32)具有顯著相關(guān)性，提示了MMP-9 用于NSCLC 預(yù)后評(píng)估具有較高的價(jià)值。而Xu 等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，血清MMP-9 水平診斷NSCLC 的AUC 可達(dá)0.890，與CEA 及NSE 的診斷效能相近(AUC 分別為0.840 及0.800)，MMP-9 的cut-off 值取為15.30ng/mL 時(shí)，診斷特異度為80.56%，敏感度為87.10%，結(jié)果提示了血清MMP-9 用于診斷NSCLC 具有較高的臨床價(jià)值。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與單個(gè)指標(biāo)相比，聯(lián)合CPA-4、MMP-9 及CEA 診斷NSCLC 的準(zhǔn)確度更高。指南也推薦在使用血清學(xué)指標(biāo)篩查NSCLC 中使用多指標(biāo)聯(lián)合來(lái)提高診斷的效能[7]。如最新的研究也顯示，胸苷激酶1(TK1)、CEA、NSE 及CYFRA21-1 等指標(biāo)聯(lián)合診斷NSCLC 的準(zhǔn)確度較單項(xiàng)指標(biāo)更高，診斷的特異度及敏感度也得到改進(jìn)，提示了多指標(biāo)聯(lián)合模型的臨床應(yīng)用價(jià)值更好[16]。而CPA-4 及MMP-9在多指標(biāo)聯(lián)合診斷評(píng)估模型中的應(yīng)用也值得進(jìn)一步的探討及驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示血清CPA-4 及MMP-9 水平用于診斷初治NSCLC 具有較高的臨床價(jià)值，且多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合能夠顯著提高診斷效能。此外，研究也存在一定的不足之處，如缺少對(duì)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)觀測(cè)和原位癌組織中CPA-4(MMP-9)的表達(dá)情況。下步的研究還需要針對(duì)這些不足加以改進(jìn)提高，并在更為前瞻性的大樣本隊(duì)列中驗(yàn)證兩項(xiàng)無(wú)創(chuàng)指標(biāo)的診斷及預(yù)后評(píng)估效能，從而為臨床提供更優(yōu)良的參考。