蔡志文，肖小平，王雪亮，邵永紅，周 潔

1)深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060； 2)湖南省計(jì)量檢測(cè)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410014

免疫傳感器是一種利用抗體和抗原之間親和作用，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物特異性檢測(cè)的裝置．在免疫傳感器的制備中，由于抗體作為識(shí)別元件提供了抗體和抗原相互作用的特異性位點(diǎn)，抗體的固定效果對(duì)抗原檢測(cè)至關(guān)重要．共價(jià)法是最常見(jiàn)的固定方法，但其通常比較耗時(shí)，且會(huì)導(dǎo)致抗體的隨機(jī)固定[1]．彼此接近的抗體會(huì)引起空間位阻效應(yīng)，進(jìn)而影響抗體對(duì)抗原的結(jié)合能力．利用抗體結(jié)合蛋白對(duì)抗體的特異性吸附可實(shí)現(xiàn)抗體的定點(diǎn)固定．葡萄球菌蛋白A(簡(jiǎn)稱蛋白A)和鏈球菌蛋白G(簡(jiǎn)稱蛋白G)可以特異性地與抗體的可結(jié)晶(fragment, Fc)段結(jié)合[2]．然而，目前鮮有評(píng)估和比較兩者與抗體結(jié)合效率的文章．

研究分子間相互作用的一般方法包括放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法[3]等，但這些方法通常需要標(biāo)記，具有數(shù)據(jù)分析復(fù)雜、不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程的缺點(diǎn)．動(dòng)力學(xué)分析法可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的結(jié)合和解離過(guò)程，表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)傳感技術(shù)無(wú)需對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)高通量的生物分子間相互作用研究．自1990年Biacore公司開(kāi)發(fā)出首臺(tái)商品化的SPR檢測(cè)儀器，SPR傳感已成為研究分子間相互作用的重要工具[4-5]．SPR傳感檢測(cè)分為強(qiáng)度型、相位型、角度型及波長(zhǎng)型方法．強(qiáng)度型SPR傳感器的檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但是動(dòng)態(tài)范圍一般只能達(dá)到 ～10-5RIU[6]，靈敏度低；相位型SPR傳感器具有較高靈敏度[7]，但其動(dòng)態(tài)范圍較小(～10-4RIU)；角度型SPR傳感器具有較高的靈敏度(～10-7RIU)和動(dòng)態(tài)范圍[8]，但是檢測(cè)設(shè)備相對(duì)復(fù)雜和昂貴[9-11]；波長(zhǎng)型SPR傳感器與強(qiáng)度型相比，其靈敏度更高，能夠達(dá)到～10-6RIU[12-13]，且動(dòng)態(tài)范圍更大[14]．波長(zhǎng)型SPR檢測(cè)設(shè)備的成本與角度型相比較低，因此，更適用于研究分子間的相互作用．本研究利用自行研制的波長(zhǎng)型SPR生物傳感設(shè)備，結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析法研究蛋白A、蛋白G與免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)的相互作用．實(shí)驗(yàn)測(cè)得IgG與蛋白A和蛋白G特異性結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù))，比較了兩者與IgG的結(jié)合能力．研究結(jié)果可為抗體固定方法優(yōu)化提供必要科學(xué)參考．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組蛋白A購(gòu)于上海市普欣生物科技有限公司,重組蛋白G購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，IgG(人種屬)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)和2-嗎啉乙磺酸-水合物(2-morpholineethanesulfonicacidhydrate,MES)均購(gòu)自上海麥克林生化有限公司，巰基十一酸(mercaptoundecanoicacid,11-MUA)和牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline,PBS)購(gòu)于上海雙螺旋生物科技有限公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

SPR成像(SPRimaging,SPRi)傳感實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示．鹵素?zé)艄庠串a(chǎn)生寬譜光經(jīng)過(guò)透鏡組L1和L2耦合進(jìn)入液芯光纖，光纖出射光經(jīng)過(guò)透鏡L3準(zhǔn)直后進(jìn)入聲光濾波器(acousticopticaltunablefilter，AOTF)．AOTF會(huì)對(duì)寬譜光進(jìn)行調(diào)制，濾波輸出窄帶光．經(jīng)AOTF出射的窄帶光經(jīng)柱面鏡CL1和CL2準(zhǔn)直擴(kuò)束為橢圓型光斑傾斜入射到棱鏡，以匹配棱鏡的空間色散，提高光能利用率．光線經(jīng)過(guò)棱鏡耦合后入射到傳感金膜，入射光在金膜表面激發(fā)SPR現(xiàn)象．最后反射光經(jīng)過(guò)透鏡組L4和L5成像至電荷耦合元件(charge-coupleddevice,CCD)相機(jī)的傳感面．AOTF和CCD由LabVIEW軟件控制，在AOTF切換1次波長(zhǎng)后，CCD進(jìn)行多次曝光得到多幅傳感面強(qiáng)度圖，平均后得到該波長(zhǎng)下的傳感面強(qiáng)度圖．AOTF掃描1個(gè)波長(zhǎng)周期后，獲得一系列不同波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的傳感面強(qiáng)度圖像．由于芯片不同點(diǎn)位的金膜厚度并不完全一致，在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，首先選取大小為30×20pixel的感興趣區(qū)域，以減小不同金膜厚度所引起的誤差．對(duì)該區(qū)域像素點(diǎn)在每個(gè)掃描波長(zhǎng)下的強(qiáng)度值進(jìn)行平均，從而得到該區(qū)域的SPR光譜曲線，通過(guò)多項(xiàng)式擬合得到該區(qū)域的共振波長(zhǎng)．金膜表面發(fā)生分子結(jié)合時(shí)會(huì)引起金膜與溶液界面的折射率變化，導(dǎo)致共振波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)，由此監(jiān)測(cè)分子間的相互作用過(guò)程．

為防止共振波長(zhǎng)超出掃描范圍，將系統(tǒng)的波長(zhǎng)掃描范圍設(shè)定為600～700nm．系統(tǒng)中AOTF作為分光器件，最小光譜分辨率為0.1nm，即掃描步長(zhǎng)最小可達(dá)0.1nm．在掃描步長(zhǎng)分別為0.1、1.0和10.0nm情況下，系統(tǒng)對(duì)同種樣品的均方根噪聲分別為0.007、0.007和0.013nm．因此，可認(rèn)為掃描步長(zhǎng)為0.1nm和1.0nm時(shí)的噪聲水平基本一致，為提高系統(tǒng)的時(shí)間分辨率，實(shí)驗(yàn)選取掃描步長(zhǎng)為1.0nm．

對(duì)待測(cè)樣品的折射率進(jìn)行估計(jì)，通過(guò)理論模擬計(jì)算出最佳的入射波長(zhǎng)以及入射角．如本次實(shí)驗(yàn)樣品的背景液為PBS(折射率為1.3347RIU)時(shí)，對(duì)應(yīng)的最佳入射波長(zhǎng)和入射角分別為662nm和71.1°．檢測(cè)過(guò)程中首先固定最佳入射波長(zhǎng)，在預(yù)估的最佳入射角附近調(diào)整入射角度，并對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的強(qiáng)度值進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)的強(qiáng)度值最低時(shí)，認(rèn)為此時(shí)的入射角為最佳入射角，然后固定該角度，對(duì)入射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描．

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置光路圖Fig.1 Light path diagram of experimental device

SPRi系統(tǒng)中使用的棱鏡由折射率為1.515的BK7玻璃制成．傳感芯片通過(guò)磁控濺射法制備，首先，在18mm×18mm的BK7玻璃基板上濺射2nm厚的Cr黏合層；然后，濺射48nm厚的金傳感層，實(shí)驗(yàn)中使用折射率匹配油將傳感芯片與棱鏡耦合．

實(shí)驗(yàn)中使用4通道流通池．流通池的模具由Solidworks制圖設(shè)計(jì)，使用計(jì)算機(jī)數(shù)控(computernumericalcontrol，CNC)方法加工而成．將配好的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膠倒入模具中，在150℃恒溫箱中固化15min．流通池尺寸為18mm×18mm，與傳感器芯片的尺寸匹配．每個(gè)通道的體積約為3μL(高度0.2mm；寬度1mm；長(zhǎng)度14mm)．

1.3 抗體結(jié)合蛋白的固定

首先，將金膜放置在等離子體清洗機(jī)內(nèi)清洗10min以增加金膜的親水性，取出冷卻后置于10mL的11-MUA乙醇溶液中浸泡過(guò)夜制備自組裝膜．利用無(wú)水乙醇和純水清洗金膜表面，氮?dú)獯蹈桑畬⑿揎椇玫慕鹉ぶ糜诶忡R之上，在金膜表面固定多通道流通池．將PBS緩沖液流入流通池，待SPR信號(hào)穩(wěn)定后，再通入含有0.2mol/LEDC和0.1mol/LNHS的MES溶液(0.1mol/L，pH=5.5)，活化金膜表面的羧基．接著通入含有100μg/mL的蛋白A或蛋白G的醋酸鈉溶液(0.1mol/L，pH=4.5)，抗體結(jié)合蛋白分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定在芯片表面．最后通入質(zhì)量濃度為1%的BSA溶液封閉未結(jié)合的NHS酯基．通入每種試劑前都要先通入PBS緩沖液對(duì)通道進(jìn)行沖洗直至SPR共振波長(zhǎng)穩(wěn)定，以清洗掉金膜表面上的非特異性結(jié)合的蛋白分子．以上實(shí)驗(yàn)都在室溫(20～25℃)下進(jìn)行，液體進(jìn)樣速度為10μL/min．

1.4 抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

抗體結(jié)合蛋白固定后，在通道中通入PBS緩沖液直至信號(hào)穩(wěn)定．將IgG用PBS溶液稀釋成2個(gè)濃度組，第1組的質(zhì)量濃度分別為1、2、4及8μg/mL；第2組的質(zhì)量濃度分別為8、15、18及25μg/mL．兩組質(zhì)量濃度梯度的IgG溶液分別通入固定了蛋白A和蛋白G的通道，IgG溶液在金膜表面與蛋白A和蛋白G發(fā)生結(jié)合反應(yīng)．反應(yīng)結(jié)束后通入PBS溶液進(jìn)行解離．SPR傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)共振波長(zhǎng)的變化，通過(guò)對(duì)共振波長(zhǎng)變化曲線進(jìn)行處理可得到相關(guān)動(dòng)力學(xué)信息．

1.5 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理方法

反應(yīng)過(guò)程符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[15]

(1)

其中， dR/dt為SPR信號(hào)對(duì)時(shí)間t的求導(dǎo)，即固定在金膜表面的抗體蛋白分子與抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速率；Rmax為物質(zhì)反應(yīng)飽和時(shí)的SPR信號(hào)；ka為結(jié)合速率常數(shù)；kd為解離速率常數(shù)；c為分析物的質(zhì)量濃度(單位：mol/L)．通過(guò)對(duì)dR/dt～R進(jìn)行線性擬合，可求出斜率kac+kd； 再對(duì)(kac+kd)～c線性擬合，可求出斜率ka和截距kd． 若要求得更精確的kd，需從解離段數(shù)據(jù)中求取，解離段具有如下關(guān)系

(2)

對(duì)式(2)積分可得

ln(R0/Rt)=kd(t-t0)

(3)

其中，R0與Rt分別是t0和t時(shí)刻的SPR信號(hào)．以ln(R0/Rt)～(t-t0)作圖或線性擬合可求出斜率kd．

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體結(jié)合蛋白的固定

圖2為蛋白A和蛋白G固定過(guò)程中共振波長(zhǎng)的實(shí)時(shí)變化曲線．自組裝金膜表面通入含有0.2mol/LEDC和0.1mol/LNHS的MES溶液時(shí)，共振波長(zhǎng)發(fā)生劇烈變化，這是由于MES溶液與PBS溶液較大的折射率差異所引起，金膜表面羧基活化后共振波長(zhǎng)實(shí)際增加約2nm．抗體結(jié)合蛋白共價(jià)固定在金膜表面過(guò)程中共振波長(zhǎng)逐漸增加，PBS沖洗后蛋白A和蛋白G結(jié)合區(qū)域共振波長(zhǎng)分別提高2.7nm和3.0nm，說(shuō)明抗體結(jié)合蛋白成功固定在金膜表面．BSA封閉后，共振波長(zhǎng)進(jìn)一步增加，表明BSA在芯片上已固定．

圖2 抗體結(jié)合蛋白固定過(guò)程的共振波長(zhǎng)變化監(jiān)測(cè)Fig.2 Resonance wavelength monitoring of the immobilization of antibody-binding protein

2.2 IgG與抗體蛋白的動(dòng)力學(xué)分析

圖3(a)和圖3(b)分別為蛋白A和蛋白G與IgG反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線圖．由式(2)和式(4)可以求出蛋白A與IgG的ka≈1.3×105L·mol-1·s-1、kd≈2.1×10-2s-1，蛋白G與IgG的ka≈5.0×104L·mol-1·s-1、kd≈5.0×10-3s-1．就結(jié)合速率相比，蛋白A與IgG的結(jié)合速率更大，說(shuō)明蛋白A與IgG結(jié)合更快，單位時(shí)間里結(jié)合形成更多的復(fù)合物，結(jié)合效率更高．就解離速率相比，蛋白G與IgG的解離速率更小，說(shuō)明單位時(shí)間里解離程度小，形成的復(fù)合物相對(duì)穩(wěn)定．重組蛋白A有5個(gè)IgG的Fc區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)，重組蛋白G則只有2個(gè)或3個(gè)[16-18]，位點(diǎn)越多更容易結(jié)合，這可能是蛋白A與IgG能在單位時(shí)間里結(jié)合次數(shù)更多的原因．蛋白A與IgG的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)與文獻(xiàn)[19]中的量級(jí)一致，蛋白G的結(jié)合速率常數(shù)與文獻(xiàn)[20]中量級(jí)一致．kd/ka是體現(xiàn)親和力大小的指標(biāo)，比值越小則親和力越強(qiáng)．蛋白A與蛋白G相比kd/ka值較大，說(shuō)明它對(duì)IgG的親和力較小．這可能是由于重組蛋白G已經(jīng)除去了與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，減少了交叉反應(yīng)與非特異性結(jié)合，因此，蛋白G比蛋白A具有更強(qiáng)的親和力．

圖3 抗體結(jié)合蛋白與 IgG動(dòng)力學(xué)反應(yīng)曲線Fig.3 Kinetic curves of the interactions between antibody-binding proteins and IgG

結(jié) 語(yǔ)

SPR傳感技術(shù)是一種新型生化分析技術(shù)手段，被廣泛應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)、環(huán)境檢測(cè)和疾病診斷等領(lǐng)域．該技術(shù)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、核酸-蛋白質(zhì)及受體-配體等分子間的相互作用．本研究利用自研的波長(zhǎng)型SPR生物傳感器研究蛋白A、蛋白G與免疫球蛋白IgG的相互作用，并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析計(jì)算．結(jié)果表明，該傳感器可用于研究生物分子相互作用及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，計(jì)算得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)量級(jí)與文獻(xiàn)中相似．對(duì)比蛋白A和蛋白G與IgG的結(jié)合和解離速率參數(shù)可以得出，蛋白A與IgG的結(jié)合效率更高，而蛋白G與IgG形成的復(fù)合物更穩(wěn)定，蛋白對(duì)IgG的親和力更強(qiáng)．本研究結(jié)果為抗體固定方法的優(yōu)化提供必要的參考和理論支撐．