宮 婷

（遼寧省桓仁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，遼寧 桓仁 117200）

非洲豬瘟簡(jiǎn)稱ASF（African swine fever），是一種容易引起家豬或者野豬發(fā)生急性、熱性的傳染性疾病，其傳播途徑通過(guò)密切接觸而來(lái)，其病原名稱為非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV），被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIF）定性為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)定性一類疫病[1]。在我國(guó)，首例被確診的非洲豬瘟是在2018 年8月，從此之后，非洲豬瘟已經(jīng)蔓延到了全國(guó)多個(gè)省市自治區(qū)和直轄市，給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)及配套產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到了市場(chǎng)的肉類供應(yīng)。

目前，國(guó)際上針對(duì)此病還沒(méi)有研制出可以預(yù)防的有效疫苗，防控疫病的方法主要采取生物安全措施。針對(duì)ASF 做及時(shí)明確的病原學(xué)檢測(cè)可以有效的為制定各項(xiàng)防控措施提出指導(dǎo)，對(duì)于疫病防控實(shí)施效果評(píng)估提供有利的依據(jù)。文章將主要的病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了解析，為ASF 的防控工作以及研發(fā)高效可行的診斷技術(shù)提供了參考內(nèi)容。

1 病毒分離

首先要從病豬身上采集血液、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，在其樣本上接種諸如豬肺泡巨噬細(xì)胞這樣的原代細(xì)胞，ASFV 在這些容易受到感染的細(xì)胞中產(chǎn)生病變同時(shí)產(chǎn)生復(fù)制。如果在培養(yǎng)的細(xì)胞組織中注入豬紅細(xì)胞，那么絕大多數(shù)的ASFV 就會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生吸附的反應(yīng)，這種包圍豬紅細(xì)胞的狀態(tài)有一個(gè)好聽(tīng)的名字叫“玫瑰花環(huán)”。由于還有一部分的非洲豬瘟病毒株對(duì)于紅細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生吸附反應(yīng)，如果在分離培養(yǎng)的組織中沒(méi)有出現(xiàn)吸附反應(yīng)而是產(chǎn)生了細(xì)胞裂變，那么就要通過(guò)免疫熒光或者是PCR 的方式來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn)，看看是否有非洲豬瘟病毒的存在；檢測(cè)中需要注意，免疫熒光和PCR 要傳代3-5 次成陰性反應(yīng)才可以被認(rèn)可為陰性。如果是首次爆發(fā)ASF 的地區(qū)，在通過(guò)PCR 或者免疫熒光等方法監(jiān)測(cè)的結(jié)果都是陽(yáng)性的話，就需要再進(jìn)行紅細(xì)胞吸附反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證[2]。

2 抗原檢測(cè)

2.1 免疫熒光法

免疫熒光法是ASF 的檢測(cè)方法之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織所推薦。這個(gè)方法是針對(duì)臟器涂片或者薄層冷凍切片等加入異硫氰酸熒光素來(lái)標(biāo)記抗ASFV 特異性抗體，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。這種檢測(cè)方法主要是針對(duì)不產(chǎn)生HAD 的ASFV 毒株感染進(jìn)行鑒別工作，還可以用來(lái)對(duì)ASFV 產(chǎn)生CPE和其它病毒產(chǎn)生CPE 進(jìn)行區(qū)別。免疫熒光檢測(cè)法對(duì)于急性ASF 感染的檢測(cè)時(shí)效極高，但是對(duì)于亞急性或者是慢性感染的檢測(cè)就不那么迅速了，這與感染組織可能已經(jīng)異變成抗原體復(fù)合物阻止了與檢測(cè)用抗體相結(jié)合的通道有關(guān)[3]。

2.2 ELISA 法

ELISA 檢測(cè)法是通過(guò)Wardley 等用抗ASFV的特異性血清IgG 作為包被蛋白而進(jìn)行的檢測(cè)法，其對(duì)于 ASFV 抗原檢測(cè)濃度為 50-500 HAD50/ml。基于p72（病毒衣殼蛋白）單抗的雙抗夾心ELISA 法具有較強(qiáng)的靈敏度[3]。目前，針對(duì)這種檢測(cè)方法，已經(jīng)發(fā)明了ASFV 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒，其設(shè)備要求低，使用起來(lái)簡(jiǎn)單，性價(jià)比高，在市場(chǎng)上流通很快，但是與熒光定量PCR 檢測(cè)法相比，檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性還需要進(jìn)一步的提升。

2.3 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是用抗VP72 蛋白單克隆抗體研制而成的。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條可以檢測(cè)病毒的含量是超過(guò)104HAU 的樣本，通過(guò)臨床試驗(yàn)可以看出，三種檢測(cè)方式其準(zhǔn)確率不同，檢測(cè)率最高最準(zhǔn)確的是PCR，其次就是檢測(cè)率達(dá)60 % 的試紙條，而抗原間接ELISA 試劑盒僅有48 % 的準(zhǔn)確率[4]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

除了免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，還有分子生物學(xué)檢測(cè)法，其檢測(cè)反應(yīng)更為精準(zhǔn)，更加適用于高通量檢測(cè)。上文提到OIE 推薦的PCR 檢測(cè)法是普遍認(rèn)可的ASFV 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)于PCE 的探索國(guó)內(nèi)外學(xué)者從未停止，目前甚至出現(xiàn)數(shù)字PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增等方法[5]。

3.1 常規(guī)PCR 檢測(cè)法

常規(guī)PCR 檢測(cè)法針對(duì)ASFV 最多能檢測(cè)的DNA 數(shù)值是從幾十到上百。通過(guò)VP72 基因設(shè)計(jì)而建立起的常規(guī)PCR 檢測(cè)法是可以檢測(cè)到0.12HAU50濃度的ASFV，而且其特異性表現(xiàn)良好，是OIE 推薦的檢測(cè)方法。

除可以單獨(dú)檢測(cè)ASFV 的方法，更有檢測(cè)多種病原的PCR 檢測(cè)方法。如可以同時(shí)對(duì)ASFV、豬瘟病毒、高致病性藍(lán)耳病病毒和為狂犬病病毒進(jìn)行檢測(cè)的多重PCR 法[6]。

3.2 熒光定量PCR 檢測(cè)法

熒光定量PCR 檢測(cè)法比常規(guī)PCR 檢測(cè)對(duì)于基因片段的擴(kuò)增更短，不僅反應(yīng)快速，而且最低檢出的限度可以從幾個(gè)到幾十個(gè)拷貝的DNA 模板。在操作時(shí)不用開(kāi)蓋的優(yōu)點(diǎn)降低了擴(kuò)增產(chǎn)物被污染的可能性，因此是現(xiàn)今ASFV 檢測(cè)被使用頻率最高的方法。

3.3 恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

近幾年，分子診斷技術(shù)越來(lái)越成為研究重點(diǎn)，恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其優(yōu)勢(shì)在于可以降低實(shí)驗(yàn)操作成本，不用通過(guò)造價(jià)較高的熱循環(huán)設(shè)備，只需使用普通的水浴設(shè)備就可以在單一溫度中進(jìn)行測(cè)試，而且反應(yīng)迅速；在檢測(cè)時(shí)肉眼直觀的可以根據(jù)體系中染料色彩變化或者時(shí)試紙條上檢測(cè)線來(lái)分辨結(jié)果，是一種可以現(xiàn)場(chǎng)完成測(cè)試的檢測(cè)方法[7]。

4 小結(jié)

綜上所述，依據(jù)我國(guó)對(duì)于ASF 防控政策，對(duì)于ASFV 的分離和鑒定還沒(méi)有完全放開(kāi)，只能在特定的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，盡管試紙條和ELISA 這樣的檢測(cè)方法既便利又快捷，但是受制于檢測(cè)限，也只能用來(lái)檢測(cè)急性病例和病死豬而已。對(duì)非洲豬瘟的防控研究，還有很長(zhǎng)的一段路要走，希望在未來(lái)的科學(xué)研究中，能夠早日打破現(xiàn)在的局面，讓抗疫疫苗早日面世。