孟文博，連歡，趙翰卿，彭勇

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271000）

殼聚糖是甲殼素脫乙酰后的天然產(chǎn)物，也是自然界中唯一的天然堿性多糖[1]。由于殼聚糖具有良好的成膜特性、生物相容性和全降解特性[2-3]，在藥品和食品領(lǐng)域通常作為包裝的基材之一。研究表明，果蔬經(jīng)殼聚糖涂膜處理后，貯藏期間，果蔬的呼吸作用降低、失重減少，可以獲得較長的保鮮期[4-5]，殼聚糖涂膜也可以抑制病原菌和腐敗微生物的生長，延緩果蔬的腐爛變質(zhì)[6-8]。殼聚糖膜的組成、性能和結(jié)構(gòu)都與保鮮效果密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步提高殼聚糖膜的抗菌特性及應(yīng)用價(jià)值，植物精油常被加入殼聚糖膜中，提高復(fù)合膜的抗菌性。植物精油是從植物的根、莖、葉、花或果實(shí)中提取的芳香物質(zhì)，由于含有各種酚類、醛類、醇類、酯類等活性成分，具有很強(qiáng)的抗菌特性[9-11]。研究表明牛至精油、百里香精油、丁香精油等均具有較強(qiáng)的抗菌能力[12]。作為天然產(chǎn)物，植物精油通常被認(rèn)為是安全的[13]，但由于植物精油易于揮發(fā)，單獨(dú)使用時(shí)抗菌時(shí)效短，研究控制植物精油從膜中釋放的技術(shù)措施尤為重要。

殼聚糖膜復(fù)合植物精油可以延遲精油的釋放，精油的釋放與保留受殼聚糖膜結(jié)構(gòu)、精油類型、乳化劑等多種因素的影響[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，乳化劑可以降低油水兩相之間的表面張力，促進(jìn)精油在水相的溶解，乳化劑對(duì)精油粒徑和膜溶液的穩(wěn)定性都有一定影響。并且，乳化劑的乳化效果與親水親脂平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB） 值密切相關(guān)，HLB 值越高，說明對(duì)水的親和力越強(qiáng)[16]。目前為止，復(fù)配型乳化劑的HLB值影響殼聚糖精油復(fù)合膜的性能及結(jié)構(gòu)的研究鮮有報(bào)道。

本研究利用吐溫和司盤復(fù)配得到不同HLB值的乳化劑，添加到殼聚糖-百里香精油復(fù)合膜中，考察乳化劑的HLB值對(duì)復(fù)合膜的物理性能、抗氧化能力和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為活性抗菌多糖膜的制備及應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用殼聚糖（脫乙酰度90.2%）：上海源葉生物科技有限公司；百里香精油：廣州文玲貿(mào)易有限公司；吐溫 80、司盤 80、甘油、冰乙酸、1，1-二苯基-2-吡啶肼（DPPH）（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；OMST-150C螺旋測(cè)微器：南京蘇測(cè)計(jì)量儀器有限公司；WSC-S色差計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CL-3250A恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器：天津奧特賽斯儀器有限公司；IKA T18均質(zhì)分散機(jī)：德國IKA公司；TW-2A循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；BI-90 plus激光粒度分析儀：美國布魯克海文儀器公司；JSM-6610掃描電子顯微鏡：日本JEOL有限公司；UV-5100 B紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳化劑添加量的篩選

參照申莉莉的方法[17]，添加不同比例的吐溫80和司盤80，分別配制成HLB值分別為9、11、13、15的4種復(fù)配乳化劑。以乳化劑和百里香精油體積比為1∶10和1∶5兩個(gè)比例混合，測(cè)定乳液的粒徑，考察乳化劑添加量對(duì)百里香精油的乳化效果，篩選復(fù)配比例。

1.3.2 復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取4.5 g殼聚糖粉末，加入300 mL的0.5%乙酸水溶液中，配制成1.5%的殼聚糖膜溶液。待殼聚糖溶解完全后，加入30%的甘油（30%殼聚糖）作為增塑劑。然后，將1%的百里香精油及乳化劑（乳化劑和精油比例為1∶5）加入膜溶液，膜溶液用均質(zhì)分散機(jī)在12 000 r/min條件下均質(zhì)3 min后用真空抽氣泵抽氣30 min，將膜溶液倒在自制玻璃板上，室溫（25℃）下干燥成膜。最后將膜貯藏于相對(duì)濕度53%的干燥器（含有過飽和硝酸鎂溶液）中備用。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，設(shè)置不加乳化劑、不加精油的對(duì)照CK1，同時(shí)設(shè)置不加乳化劑、只加精油的對(duì)照CK2，并以乳化劑HLB值的不同設(shè)置 TS9、TS11、TS13、TS15四個(gè)處理。

表1 復(fù)配乳化劑的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design table for compounding emulsifier

1.3.3 膜溶液粒徑的測(cè)定

根據(jù)Li所述的方法[18]，通過激光粒度分析儀測(cè)量溶液的粒徑。膜溶液用蒸餾水稀釋100倍，設(shè)定參數(shù)為折射率1.33和測(cè)試角90°，在25℃下進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)3次測(cè)試。

1.3.4 膜厚度及顏色的測(cè)定

采用數(shù)字螺旋測(cè)微器，在6個(gè)隨機(jī)點(diǎn)上測(cè)量薄膜的厚度，測(cè)量精度為0.001 mm。

依照CIE LAB表色系統(tǒng)來表示顏色，采用WSC-S色差儀測(cè)定膜的顏色。以白板作色差測(cè)定參比，每個(gè)處理測(cè)6次，取平均值，分別記錄膜的L*、a*和b*。

1.3.5 含水量（moisturecontent，MC）、膨脹程度（swelling degree，SD）、水溶性（water solubility，WS）以及水蒸汽透過率（water vapor permeability，WVP）的測(cè)定

根據(jù)Homez-Jara[19]的方法略作修改，測(cè)定殼聚糖精油復(fù)合膜含水量、溶脹度、水溶性，膜切割成20 mm×20 mm的正方形，稱其重量，記為m1。然后將裁好的膜片放入烘箱中，溫度為105℃，烘干24 h后取出，放入干燥器中冷卻后稱重，記為m2。量取30 mL蒸餾水，將膜放入水中，放置24 h后取出，擦去表面水分后稱重，記為m3。再放入烘箱內(nèi)干燥24 h，得到膜最終的質(zhì)量m4。每一組膜測(cè)定3次。

參考彭勇等[20]的方法測(cè)定復(fù)合膜的水蒸汽透過率。薄膜（60 mm×60 mm）覆蓋在含有無水氯化鈣的稱量瓶上，將稱量瓶稱重（M1），然后，放入含有飽和氯化鈉溶液的干燥器中，放置7 d后稱重，記為M2，復(fù)合膜的水蒸汽透過率[WVP，g/（m·s·Pa）]用下式計(jì)算。

式中：（M2-M1） 為稱量瓶重量的變化，g；L 為膜厚度，m；A 為膜的有效面積，m2；t為貯藏時(shí)間，s；△P為薄膜兩側(cè)的水蒸汽壓差，Pa。

1.3.6 抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長率的測(cè)定

根據(jù)GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的測(cè)定第3部分：薄膜和薄片的實(shí)驗(yàn)條件》塑料拉伸性能的測(cè)定方法略作修改測(cè)定膜的拉伸性能[21]。試驗(yàn)前將薄膜放置在相對(duì)濕度53%，23℃條件下48 h。首先將薄膜切成15 mm×150 mm長方形，用XLW拉伸試驗(yàn)機(jī)測(cè)定薄膜拉伸強(qiáng)度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（percentage of breaking elongation，EAB）。拉伸速度為10 mm/min，初始距離為100 mm，每組6次重復(fù)測(cè)試。

1.3.7 抗氧化性的測(cè)定

參照張小燕等的方法[22]，將膜樣切成20mm×20mm，在含有10 mL甲醇中，放置10 min。然后，吸取200 μL樣品溶液與2 mL的DPPH甲醇溶液混合，其中以200 μL的甲醇代替樣品作為對(duì)照組，在25℃的黑暗中放置30 min。于516 nm處測(cè)定吸光度。用下面公式計(jì)算。

式中：Af和Ab分別是薄膜樣品和對(duì)照組的吸光度值。

1.3.8 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像

在測(cè)試前，薄膜至少干燥7 d，并在液氮中斷裂。然后將樣品切成長方形（1 mm×6 mm），粘在金屬板上，真空鍍金，用掃描電鏡在5 kV條件下觀察薄膜樣品的表面和截面形貌。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)通過SPSS軟件ANOVA分析（版本24.0），并進(jìn)行鄧肯多樣本差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖膜溶液粒徑的影響

不同復(fù)配乳化劑的膜溶液粒徑如表2所示。從表2中可以看出，當(dāng)乳化劑與精油混合時(shí)，無論體積比是1∶10還是1∶5，HLB值在9～15之間均可獲得較小的精油粒徑，1∶5時(shí)精油粒徑較小，而沒有乳化劑的對(duì)照組精油粒徑最大。

表2 乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油膜溶液粒徑的影響Table 2 Effect of emulsifier HLB value on the particle size of chitosan-essential oil composite films solution

根據(jù)乳化效果，選擇乳化劑和精油1∶5（體積比）的復(fù)配比例，制備殼聚糖復(fù)合膜溶液，可以看出隨著乳化劑HLB值的升高，膜溶液的粒徑逐漸下降，HLB值為15時(shí)，粒徑最小，其值為656.4 nm。粒徑較小的乳液通常意味著較好的乳化效果，復(fù)合膜溶液混合體系也更穩(wěn)定[16]。

2.2 復(fù)配乳化劑HLB值對(duì)膜顏色及厚度的影響

乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜顏色和厚度的影響見表3。

表3 乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜顏色和厚度的影響Table 3 Effect of emulsifier HLB value on color and thickness of chitosan-essential oil composite films

由表3可知，未加精油的CK1膜的L*值為92.50、a*值為-1.01，b*值為 8.90，膜透明、亮度大、黃色淡。加入精油后的對(duì)照膜CK2的L*值顯著降低，膜的顏色加深。這可能是精油本身的顏色導(dǎo)致的。添加不同HLB值的復(fù)配乳化劑后，膜的L*值增加、b*值下降，但是乳化劑的HLB值與膜顏色之間無顯著相關(guān)性。

從膜厚度來看，未添加精油的CK1膜厚度最小，僅0.072 mm，添加精油后的CK2膜，厚度顯著增加。而添加乳化劑之后，膜的厚度顯著下降，以TS15膜的厚度最小，膜的厚度是由膜的組成成分和各組分之間的相互作用決定的[23]，乳化作用使得精油粒徑變小，各組分間的相互作用減弱，從而降低了膜厚度。

2.3 膜的含水量、膨脹程度、水溶性及水蒸汽透過率的分析

乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜的物理性能（包括含水量、水溶性、膨脹程度和水蒸汽透過率）的影響見表4。

表4 乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜含水量、膨脹程度、水溶性和水蒸汽滲透率的影響Table 4 Effect of HLB value of emulsifier on water content，swelling degree，water solubility and water vapour permeability of chitosan-essential oil composite films

從結(jié)果來看，未添加精油的對(duì)照CK1膜含水量和膨脹程度最高、水溶性和水蒸汽透過率最小，添加精油后的對(duì)照CK2膜，其含水量和膨脹度顯著下降，而CK2膜的水溶性和水蒸汽透過率顯著增加，表明百里香精油可以衰弱殼聚糖與水分子之間的相互作用。添加不同HLB值的乳化劑之后，復(fù)合膜的含水量略有增加，水溶性顯著降低，但膨脹程度差異不大，并且乳化劑HLB值與膜的含水量、水溶性、水蒸汽透過率等無相關(guān)性。吐溫和司盤都是非離子型乳化劑，乳化劑的加入不但降低了殼聚糖與精油的相互作用，而且乳化劑本身也影響了復(fù)合膜的性能[24]，從而導(dǎo)致了含水量、水溶性等指標(biāo)的變化。

2.4 不同HLB值的乳化劑對(duì)膜拉伸性能的影響

乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜的拉伸性能（包括抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率）的影響見圖1。

圖1 乳化劑HLB值對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率的影響Fig.1 Effect of emulsifier HLB value on tensile strength and elongation at break of chitosan-essential oil composite films

如圖1所示，與CK1相比，加入百里香精油的CK2的復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度變化不大，但是增加了膜的斷裂伸長率，這與Zinoviadou在乳清蛋白膜中添加牛至精油觀察到斷裂伸長率增加的結(jié)果是一致的[25]。加入乳化劑之后，隨著乳化劑HLB值的增加，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度表現(xiàn)不一致，HLB值為13的復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度最大，而TS15抗拉強(qiáng)度最小，從斷裂伸長率來看，與CK2相比，乳化劑降低了膜的斷裂伸長率，并且，隨著乳化劑HLB的增加，膜的斷裂伸長率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率與膜體間各組分的相互作用及膜的結(jié)晶程度有關(guān)，乳化劑可以調(diào)節(jié)水相和油相的相互作用，因而使得復(fù)合膜的力學(xué)性能更均衡。

2.5 抗氧化劑活性分析

DPPH自由基清除率是衡量抗氧化活性的重要方法之一。純殼聚糖膜本身具有較低的抗氧化能力，其DPPH自由基清除率為10.90%，見圖2。

圖2 不同HLB值的乳化劑殼聚糖精油復(fù)合膜的自由基清除率Fig.2 Free radical scavenging rate of emulsifier chitosan-essential oil composite films with different HLB values

精油的添加顯著提高了薄膜的抗氧化能力，這與精油中含有較多的酚類成分有關(guān)。乳化劑的添加對(duì)膜的抗氧化能力影響不同，HLB值為9時(shí)，復(fù)合膜的抗氧化能力顯著降低，可能是不同HLB值的乳化劑對(duì)油水相的影響不同。HLB值為9時(shí)，乳化劑乳化精油的效果較差，但卻導(dǎo)致了膜體作用力的下降，從而導(dǎo)致了精油的揮發(fā)[26]，使得DPPH自由基清除率下降。而隨著HLB的增加，乳化作用加強(qiáng)，精油被限制在膜體中，提高了膜的抗氧化能力。

2.6 掃描電鏡

殼聚糖復(fù)合膜的掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像見圖 3。

圖3 殼聚糖復(fù)合膜的SEM圖像Fig.3 SEM images of chitosan composite films

圖3中可以看出，百里香精油可以均勻的分布于膜中，膜的微觀結(jié)構(gòu)主要與膜中精油的含量和粒徑有關(guān)[27]。CK1膜表面和截面質(zhì)地光滑，而CK2膜由于精油的加入，其膜表面和截面的粗糙度顯著增加，并且精油顆粒大，粒徑不均勻。而添加乳化劑后，乳化劑降低了精油的粒徑和膜表面孔隙度，從表面圖像來看，TS9的膜表面無精油附著，表明其膜體作用力弱，精油難以留在表面，易于揮發(fā)，這與抗氧化的結(jié)果（DPPH自由基清除率低）是一致的。但HLB值在11～15之間，乳化劑對(duì)精油粒徑和膜結(jié)構(gòu)的影響并不顯著，這可能與精油、乳化劑及殼聚糖的相互作用有關(guān)。

3 結(jié)論

乳化劑對(duì)殼聚糖精油復(fù)合膜有較好的乳化作用，精油粒徑的大小會(huì)隨復(fù)配乳化劑HLB值的增加而減小，使殼聚糖-精油復(fù)合膜乳液更加穩(wěn)定。一定HLB值的乳化劑可以提升殼聚糖-精油復(fù)合膜的抗氧化性能。添加不同HLB值的乳化劑，對(duì)膜的物理性能也有不同的影響。綜合來看，添加TS13復(fù)配乳化劑的復(fù)合膜性能較好，可以獲得較低的膨脹程度和水蒸汽透過率，提升膜的抗拉強(qiáng)度，有助于改善殼聚糖精油復(fù)合膜的性能，得到性能優(yōu)良的抗菌活性包裝。