周煜，薛璐，2*，吳子健，2，胡志和，2

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

啤酒是一種世界范圍流行的酒精飲料，2016年啤酒在歐洲國家的年人均消費量是71 L[1]，啤酒通常以大麥芽、啤酒花和水為原料，經酵母菌發(fā)酵得到。氣味是啤酒重要的感官特征[2]。目前對啤酒氣味的研究主要是從化學成分的角度對啤酒氣味形成的原因進行解釋。啤酒的氣味是啤酒中所有化合物共同產生的結果，醇類、有機酸、酯類是影響最大的三類化合物[3]。啤酒老化對啤酒的氣味影響較大[4]，與啤酒老化有關的化合物和相應的機理已經比較清楚[5]，但是如何有效減緩，甚至終止啤酒的老化仍然沒有突破性進展。本文綜述了啤酒中主要風味化合物的來源和其對啤酒氣味的影響，為今后啤酒的開發(fā)和生產提供了一定的理論參考。

1 啤酒氣味與揮發(fā)性成分的關系

啤酒的氣味是由啤酒的揮發(fā)性成分直接決定的，這些揮發(fā)性成分按照化學結構可分為胺類、含硫化合物、醇類、酚類、醛類、有機酸、酮類、酯類等[6-14]。其中，含硫化合物主要呈現(xiàn)出類似洋蔥、大蒜的刺激性氣味；醇類呈現(xiàn)出花香、葡萄酒氣味；酚類呈現(xiàn)出煙熏和辛辣的氣味；醛類根據(jù)結構不同，可能呈現(xiàn)出硬紙板、生魚、水果香氣等截然不同的氣味；酯類則會呈現(xiàn)豐富的黃油香、奶糖香、各種水果香等氣味。各種揮發(fā)性物質中，乙醛、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯等是啤酒主要的風味化合物[15]。綜合文獻檢測到的揮發(fā)性成分及其氣味描述如表1所示。

啤酒中的風味成分鑒定通常借助氣相色譜質譜聯(lián)用法 （gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）。提取風味成分可以使用頂空進樣法（head space，HS）、頂空固相微萃取法（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）、頂空吸附萃?。╤eadspace sorptive extraction，HSSE）、攪拌棒吸附萃取法（stir bar sorptive extraction，SBSE）、同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）、溶劑輔助風味蒸發(fā)（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）等手段[16]。其中HS-SPME由于操作方便、效率高、重現(xiàn)性好的特點，使用得最多。例如陳華磊等[17]使用HS-SPME-GCMS檢測了啤酒中的癸酸、癸酸乙酯、辛酸、辛酸乙酯、異戊醇、香葉烯、乙酸苯乙酯的質量濃度，結合偏最小二乘-判別分析建立了啤酒爽口性的預測模型，能夠迅速有效地評價啤酒的爽口性，對27個未知樣品檢測的準確率為74.07%。Riu-Aumatell等[18]用HS-SPMEGC-MS檢測出了啤酒中的59種揮發(fā)性成分，其中醇類20種，酯類13種，醛類8種。Pizarro等[19]用HSSPME結合氣相色譜串聯(lián)質譜測定了啤酒中揮發(fā)性成分的含量。Richter等[20]使用 HS-SPME、SAFE、SBSE、HSSE這4種方法分別對相同啤酒中的來源于啤酒花的14種揮發(fā)性化合物進行提取并檢測，結果顯示只有HSSE和SBSE能夠吸收這14種化合物，并且HSSE對其中11種化合物的吸附能力很強，但是HSSE的重現(xiàn)性較SBSE差一些，而HS-SPME只能吸附其中12種化合物。

表1 啤酒揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in beer

續(xù)表1 啤酒揮發(fā)性成分Continue table 1 Volatile components in beer

續(xù)表1 啤酒揮發(fā)性成分Continue table 1 Volatile components in beer

續(xù)表1 啤酒揮發(fā)性成分Continue table 1 Volatile components in beer

2 酵母菌對啤酒氣味的影響

在發(fā)酵過程中酵母菌將麥芽汁中的糖類轉化為醇類、有機酸、酯類等風味物質[21]。根據(jù)所用酵母菌不同，啤酒可分為拉格和艾爾兩種。通常情況下，艾爾啤酒以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在較高溫度發(fā)酵（14℃ ～19℃），拉格啤酒以巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）在較低溫度發(fā)酵（4℃ ～19℃）[22]。釀制精釀啤酒通常選擇Saccharomyces cerevisiae，這是因為Saccharomyces cerevisiae的乙醇產量高、發(fā)酵效率高、能夠發(fā)酵的糖類種類廣[23]。不同的酵母菌以及其接種比例對啤酒氣味有很大影響，只采用釀酒酵母發(fā)酵會導致啤酒風味單調，因此一些精釀啤酒在釀造過程中加入一些非釀酒酵母作為產香酵母。Toh等對麥芽汁混合接種Saccharomyces cerevisiae和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），得到的啤酒中癸酸乙酯、月癸酸乙酯、乙酸香茅酯等揮發(fā)性化合物的含量顯著高于用單種酵母菌釀造的啤酒（P<0.05），說明酵母菌合理的混合接種能夠提高啤酒的揮發(fā)性成分的含量[24]。王偉等分離到了一株高產酯類和高級醇的酵母菌LX15，LX15能夠與釀酒酵母協(xié)同產生更多酯類和高級醇，LX15經鑒定為畢赤酵母屬的Pichia myanmarensis[25]。同種酵母菌不同菌株也可能在啤酒中產生不同的揮發(fā)性成分，如Dack等的研究顯示，使用相同的麥芽釀制啤酒，釀酒酵母A01的高級醇和酯類產量要低于S288c和L04兩種釀酒酵母，相比L04，S288c產生大約2倍的高級醇和20倍的酯類[26]。

高級醇和酯類是啤酒中最重要的風味活性化合物[27]，均主要來自于酵母菌的代謝。高級醇是含3個以上碳原子醇類的總稱，俗稱雜醇油。在酵母菌的次生代謝產物中，除乙醇外，高級醇的含量是最高的。在酵母菌細胞內，氨基酸在轉氨酶（由基因BAT1、BAT2編碼）的作用下轉化為α-酮酸[28]，然后在脫羧酶（由基因ARO10、PDC1、PDC5、PDC6 編碼） 的作用下脫羧產生相應的醛類[29]，最后在甲醛脫氫酶（由基因ADH1-5、SFa1編碼）的作用下生成相應的醇[30]（見圖1）。

除醇類以外，酵母菌在發(fā)酵過程中可以在細胞質中生產酯類。酯類大多都能賦予啤酒水果的香味，相比醇類，啤酒中酯類的含量較低，但是由于酯類之間的協(xié)同作用，即使含量低于其風味閾值，仍然能夠對啤酒的氣味產生重要的影響[31]。啤酒中揮發(fā)性酯類可分為兩種：乙酸酯和脂肪酸乙酯。在酵母菌合成酯類的過程中，脂肪酸首先與輔酶A（CoA）結合產生?；o酶A，然后在酵母產生的其它酶的作用下與醇發(fā)生縮合反應，產生相應的酯類（見圖2、圖3）。

圖1 高級醇的形成機理Fig.1 Formation mechanism of higher alcohols

圖2 乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的形成過程Fig.2 Formation of ethyl acetate,isoamyl acetate and phenethyl acetate

圖3 己酸乙酯和辛酸乙酯的形成過程Fig.3 Formation of ethyl hexanoate and ethyl caprylate

其中AATasesI和AATasesII分別由基因ATF1和ATF2編碼[32]，AEATases由基因 Eeb1 和 Eht1編碼[33]。這些酶由酵母菌產生。在啤酒儲存時期，醇和酸也能自發(fā)地生成少量的酯類[34]。黑麥芽在烤制加工時的溫度比淡色麥芽更高，生成了更多的美拉德反應產物，例如類黑精。這些產物能夠促進酵母菌中醇類合成酶的活性并抑制酵母菌中酯類合成酶的活性，因此通常深色啤酒中的高級醇含量較淡色啤酒更高，而酯類含量比淡色啤酒更低[35-36]。

3 啤酒花對啤酒氣味的貢獻

啤酒花為啤酒提供了獨特的風味，根據(jù)啤酒花品種的不同，其呈現(xiàn)的風味包括柑橘香、薄荷香、青草香、松香等。啤酒花中的揮發(fā)性成分通常稱為啤酒花精油，是幾百種化合物的混合物，如萜類、一元羧酸、甲酯、含硫化合物等。啤酒花精油中含量最高的是萜烯類化合物，其中月桂烯、α-蛇麻烯、β-石竹烯這3種化合物占到了啤酒花揮發(fā)性成分的80%[37]。啤酒花中蛇麻烯的環(huán)氧化合物能產生類似干草、雪松的氣味；蛇麻二烯酮產生花香、清新的氣味；β-石竹烯的氧化物包含氧化石竹烯、14-羥基-β-石竹烯等，能夠帶來刺激性、鮮花、松木的氣味[38]。

啤酒花中的含硫化合物包括甲基硫代酸酯、噻吩、多官能團硫醇等[39]。盡管硫化物含量較低，但是人對硫化物的感官閾值也很低，因此硫化物也是啤酒花中重要的風味物質，為啤酒帶來干酪、橡膠、燒焦的氣味。例如Cascade、Citra等啤酒花就因含有多官能團硫醇而產生特殊的香氣。

萜烯類化合物極易在熬煮過程揮發(fā)，或在發(fā)酵過程中隨二氧化碳一同溢出，因此即使其在啤酒花中含量高，也幾乎不存在于成品啤酒中。萜烯在麥汁熬煮和啤酒貯藏過程中會由于氧化反應而產生相應的環(huán)氧化合物，在成品啤酒中能夠檢測到萜烯的單環(huán)氧和雙環(huán)氧化合物[40]。但是采用干投啤酒花工藝進行釀造，則啤酒中能保留一部分萜烯[41]。干投是指在啤酒發(fā)酵時再次添加啤酒花的釀造技術，能夠增強啤酒中的啤酒花香氣[42]。因此，除非使用干投工藝，啤酒花給啤酒帶來氣味的化合物不是萜烯，而是其氧化物。

啤酒花的種類、生長和貯藏條件等因素都會對啤酒中的萜類化合物產生影響[43]。例如Lafontaine等研究了在成熟期內不同時間點采摘的Cascade啤酒花的成分，發(fā)現(xiàn)能夠為啤酒帶來苦味的葎草酮的含量沒有明顯變化，而啤酒花精油的含量有顯著不同。隨著采摘時間延后，啤酒花中硫醇前體含量降低，游離硫醇含量升高。采用干投啤酒花方式釀制啤酒時，投入采摘時間較遲的啤酒花所釀制的啤酒在啤酒花香氣和水果香氣上更強烈[44]。無論在麥芽熬煮結束時，還是在啤酒后發(fā)酵結束時添加啤酒花（或啤酒花精油），得到的啤酒在酒花香氣上都比只在熬煮過程中添加啤酒花所生產的啤酒更加明顯。另外，啤酒花香氣成分能夠增強啤酒風味的穩(wěn)定性，并且有效抑制啤酒老化所產生的不良氣味，這可能是因為啤酒花中的類倍半萜烯能夠增強啤酒的抗氧化能力，沉香醇等化合物能夠掩蓋與老化有關的醛類的氣味[45]。

4 美拉德反應與啤酒的麥香風味

在啤酒的生產和貯藏過程中，由糖類和蛋白質、氨基酸等發(fā)生的美拉德反應持續(xù)進行，反應產生大量雜環(huán)化合物，如呋喃酮、吡嗪類化合物，給啤酒帶來烤面包味、香甜的風味，稱為麥香風味。2，5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮是最重要的麥香風味物質[46]。這種風味掩蓋了啤酒的苦味，也部分解釋了啤酒在貯藏過程中苦度持續(xù)降低的現(xiàn)象，是啤酒發(fā)生老化的一個原因[47]。與白酒、葡萄酒相反，老化使啤酒風味變差。一些美拉德反應中間體能夠和啤酒中其它成分反應，產生啤酒老化化合物。例如，在制麥的烤制過程中，以麥芽糖、低聚葡聚糖為起始物，反應產生了糠基乙醇，糠基乙醇和乙醇在酸的催化下，發(fā)生縮合反應產生糠基乙醚[48]。此外，與啤酒老化有關的美拉德反應產物還有2-呋喃甲醛、5-羧甲基糠醛、5-甲基糠醛等。但總的來說，美拉德反應產物的閾值較高，對啤酒的風味不良影響很小[49]。

圖4 T2N的形成機理Fig.4 Formation mechanism of T2N

5 啤酒不良氣味

在啤酒發(fā)酵過程中，丙酮酸經丙酮酸脫羧酶催化脫羧產生乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的作用下分別產生乙醇和乙酸[50]。乙醛是啤酒中主要的醛類化合物，含量過高時給啤酒帶來腐爛蘋果氣味。乙醛具有高度反應活性，能與其它羰基化合物發(fā)生縮合反應，也能與親核化合物反應，使啤酒風味劣變[51]。

啤酒在貯藏過程中發(fā)生香氣減弱、風味逐漸惡化的現(xiàn)象，這稱為啤酒的老化[52]。老化過程最明顯的風味變化是硬紙板氣味的產生，這是由反-2-壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）導致的。T2N的氣味閾值很低（0.1 μg/L），通常將其當作啤酒老化的評價指標。T2N在麥芽糖化和啤酒的老化過程中都能產生，但是產生的途徑不同。在麥芽糖化的過程中，亞麻油酸經酶的催化產生T2N[53]，在啤酒貯藏過程中，乙醛和庚醛發(fā)生縮合反應產生T2N[54]（見圖4）。T2N的產生過程很復雜，全面和具體的機理有待進一步研究。

除了T2N之外，對啤酒風味影響較大醛類化合物是Strecker醛。Strecker醛是老化氣味的關鍵化合物，包括2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、甲硫基丙醛和苯乙醛。它們由氨基酸和二羰基化合物經過Strecker降解反應生成[55]（見圖5）。

圖5 Strecker醛的形成機理Fig.5 Formation mechanism of Strecker aldehydes

Strecker醛與啤酒的老化密切相關，給人“腐敗、變質”的感覺，對啤酒的氣味有嚴重的不良影響[56]，對Strecker醛含量進行分析可以幫助預測啤酒的品質變化和貨架期[57]。目前的技術手段無法完全阻止啤酒老化的發(fā)生，只能延緩其速度，最實用的方法是對啤酒進行低溫保藏[58]。

某些啤酒中存在一種類似洋蔥的風味，這通常是含硫化合物所導致。Noba等發(fā)現(xiàn)在啤酒中的2-巰基-3-甲基-1-丁醇（2-mercapto-3-methyl-1-butanol，2M3MB）和3-巰基-3-甲基-1-丁醇（3-mercapto-3-methyl-1-butanol，3M3MB）可能是導致這種異味的原因。經測定，2M3MB、3M3MB的閾值分別為0.13、17.5 μg/L，3M3MB的閾值遠高于其在啤酒中的含量，所以2M3MB才是啤酒中類似洋蔥異味的來源[59]。進一步的研究顯示，2M3MB的前體物質是2，3-環(huán)氧-3-甲基-丁烷，這種物質來源于啤酒花，在麥芽汁的熬煮過程中發(fā)生氧化而產生的，并且在溫度較高時更容易產生。因此通過減少麥芽汁加熱過程中與空氣的接觸可以降低啤酒中2M3MB的含量，從而改善啤酒的風味[60]。

雙乙酰是啤酒發(fā)酵過程中產生的一種常見副產物，帶有獨特的類似奶油、黃油的風味，這在啤酒中是一種異味。在酵母菌細胞合成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的過程中[61]，丙酮酸經乙酰乳酸合成酶的催化生成α-乙酰乳酸。其中一部分α-乙酰乳酸通過擴散作用通過細胞膜，進入到啤酒發(fā)酵液中，并自發(fā)地轉化為雙乙酰，酵母菌細胞能夠吸收雙乙酰并將其轉化為乙偶姻等風味活性較低的物質[62-63]，這一過程如圖6所示。

圖6 雙乙酰的形成和轉化過程Fig.6 Formation and transformation of diacetyl

抑制雙乙酰的產生可以從改變發(fā)酵條件和改造酵母基因兩方面著手。Krogerus等[64]向麥芽汁中添加纈氨酸，通過反饋抑制機制使啤酒中的雙乙酰含量降低37%。高文舉等[65]研究在啤酒發(fā)酵過程中，添加適量的鋅鹽，使發(fā)酵液中Zn2+含量達到150 μg/L可以增強酵母還原雙乙酰的活力，從而加快雙乙酰的還原。Duong等[66]通過基因工程改造了啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae，使啤酒中雙乙酰的前體物質α-乙酰乳酸含量有顯著降低，而啤酒風味沒有明顯改變。石婷婷等[67]通過同源重組敲除4倍體啤酒酵母S2的α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，構建缺失兩個ILV2等位基因的突變菌株。使用該菌株釀造的啤酒中雙乙酰含量降低了45.65%。

6 結語

啤酒的氣味是風味的重要組成因素，也是消費者關注的一個重要感官指標。其變化與啤酒的揮發(fā)性化學成分有關，而這些揮發(fā)性成分主要來自酵母發(fā)酵和啤酒花。啤酒的氣味中最重要的化合物是高級醇、有機酸和酯類。美拉德反應既能夠賦予啤酒麥香風味，也會導致啤酒老化。啤酒老化主要是由啤酒中有機酸、氨基酸等化合物降解導致，與啤酒的氧氣含量、溫度和儲藏時間有關。目前沒有很好的方法抑制T2N和Strecker醛引起的風味劣變，而抑制2M3MB、雙乙酰的產生可以通過選育啤酒酵母菌株、改進發(fā)酵工藝等方法實現(xiàn)。

啤酒化學成分復雜，各種化合物對氣味影響的協(xié)同效應十分普遍。目前的研究集中在同類風味物質之間的相互影響，而對于不同類化合物之間相互作用的研究還很少。研究啤酒氣味的變化規(guī)律及穩(wěn)定性有助于提高啤酒在儲藏過程中“新鮮感”的保持時間，延長產品保質期。