李慧，韓占品，賀麗霞，楊亞苓，尤書燕，鄧琳，王春國(guó)

1天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071

0 引言

【研究意義】ERF轉(zhuǎn)錄因子隸屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族，在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用?；ㄒ耸侵匾氖卟俗魑?，土壤鹽漬及干旱是造成花椰菜種植減產(chǎn)的主要環(huán)境災(zāi)害。但對(duì)花椰菜響應(yīng)鹽及干旱脅迫的分子基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)十分有限，這已成為采用分子育種等手段創(chuàng)制花椰菜抗逆新種質(zhì)及培育新品種的重要瓶頸。因此，克隆ERF等逆境應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或基因并闡釋其功能，對(duì)開展抗逆花椰菜分子育種及基因靶向育種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中需要不斷應(yīng)對(duì)持續(xù)變化的不利環(huán)境，如動(dòng)物啃食、病原體侵染等生物脅迫和干旱、高溫、土壤鹽漬等非生物脅迫。這其中干旱、鹽害及溫度脅迫是影響植物地理分布，造成農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕收的主要環(huán)境災(zāi)害[1]。因此，闡釋植物響應(yīng)逆境脅迫的分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而在作物中開展抗逆分子育種一直是植物學(xué)研究的前沿及熱點(diǎn)領(lǐng)域。已有研究表明，WRKY、MYB、bZIP、NAC和AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)各類逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[2-3]，其中 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族為植物所特有。該家族成員具有參與 DNA結(jié)合的AP2保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域約由60個(gè)氨基酸殘基按照3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋的方式構(gòu)成一個(gè)典型三維結(jié)構(gòu)[4-6]。根據(jù) AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和識(shí)別序列的不同，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為 AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5個(gè)亞家族[7-8]。其中ERF亞家族只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，被證實(shí)主要通過識(shí)別并特異性結(jié)合各類脅迫響應(yīng)相關(guān)基因順式作用元件，而在植物抵抗各種逆境脅迫過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6,9]。水稻中ERF亞家族成員SNORKEL1（SK1）和SNORKEL2（SK2）可以促進(jìn)水稻節(jié)間伸長(zhǎng)，從而使植株可以在深水環(huán)境中存活[10]。在擬南芥中過表達(dá)菊花CmERF053的研究表明，CmERF053可能參與細(xì)胞分裂相關(guān)的側(cè)枝形成調(diào)控途徑，同時(shí)在植物抵御干旱脅迫中發(fā)揮作用[11]。大豆中GmERF6能夠被干旱誘導(dǎo)表達(dá)，將GmERF6在擬南芥中過表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)化株的抗旱性[12]。在擬南芥中過表達(dá)甜薯IbRAP2-12和蕪菁BrERF4同樣也可提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性[13-14]。PARK等[15]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtERF71/HRE2功能缺失可使突變株表現(xiàn)為鹽敏感，而將AtERF71/HRE2轉(zhuǎn)入突變體中，植株表現(xiàn)出耐鹽性，可成功抵抗?jié)B透脅迫，且提高轉(zhuǎn)化株對(duì)低氧脅迫的耐受能力。此外，研究證實(shí)，辣椒的CaERFLP1[16]和CaPF1[17]，番茄的TERF1[18]和JERF1[19]以及小麥中TaERF1[20]的過表達(dá)均可顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及低溫等逆境的適應(yīng)能力。綜上所述，ERF轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)在植物響應(yīng)逆境脅迫，特別是非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】雖然在不同植物中已有多個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子被克隆并證實(shí)其在逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，但對(duì)ERF轉(zhuǎn)錄因子在花椰菜逆境應(yīng)答中的功能及調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。筆者實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)花椰菜中的AP2/ERF家族成員采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法進(jìn)行了分析，從中篩選、鑒定到146個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，并證實(shí)包括BraERF025a等在內(nèi)的多個(gè)ERF亞家族成員在鹽及干旱脅迫前后呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)特征[21]。進(jìn)一步的分子進(jìn)化樹分析結(jié)果表明BraERF023a是與BraERF025a同屬于一個(gè)進(jìn)化分支的ERF亞家族成員，二者具有較近的親緣關(guān)系[21]。但BraERF023a是否也響應(yīng)鹽及干旱脅迫，且其是否在花椰菜抵抗鹽及干旱脅迫中發(fā)揮作用仍未知。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)花椰菜中的BraERF023a進(jìn)行克隆，揭示其序列特征，以及在鹽及干旱脅迫條件下的表達(dá)特征，并通過過表達(dá)分析闡釋BraERF023a在鹽及干旱脅迫應(yīng)答中的功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017—2019年在南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物細(xì)胞及分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試花椰菜‘津品 70’種子由天津市科潤(rùn)蔬菜研究所孫德嶺研究員惠贈(zèng)。擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型?？寺≥d體pEASY-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。植物表達(dá)載體pCAMBIA3301、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌菌株LBA4404由筆者實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 DNA提取

野生型和過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)基因擬南芥、花椰菜幼苗新鮮組織，于研缽中加入液氮快速研磨成粉末狀，采用經(jīng)典CTAB法提取DNA。ddH2O于4℃過夜溶解DNA沉淀。在溶解液中RNase A于37℃金屬浴中反應(yīng) 2 h除去 RNA。NanoDrop?ND-1000檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。高質(zhì)量的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

參照植物總 RNA提取試劑盒的操作說明提取花椰菜及擬南芥葉片總RNA。NanoDrop?ND-1000檢測(cè)提取RNA的濃度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈（具體操作參照Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行）。

1.4 花椰菜不同逆境脅迫處理

待花椰菜幼苗長(zhǎng)至四片真葉時(shí)，將幼苗從營(yíng)養(yǎng)土中取出，自來水緩緩沖洗根部，注意不要傷害到根系，隨后將幼苗分為兩組，每組至少16個(gè)單株。將其中一組幼苗根部直接浸入含有 200 mmol·L-1NaCl的水溶液進(jìn)行鹽脅迫處理；另外一組幼苗根部浸入含 20% PEG6000的水溶液中進(jìn)行模擬干旱處理。分別在0、4、8、12和24 h時(shí)摘取葉片并進(jìn)行總RNA提取。提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 不同脅迫處理?xiàng)l件下BraERF023a表達(dá)特征的定量表達(dá)分析

采用 qRT-PCR方法對(duì)花椰菜不同脅迫處理下BraERF023a的表達(dá)特征進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為20 μL，其中含有10 μL 2×SYBR Green反應(yīng)mix（羅氏公司）、1 μLBraERF023a定量引物（表 1）。以花椰菜BraActin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

1.6 BraERF023a植物過表達(dá)載體構(gòu)建

以花椰菜cDNA為模板擴(kuò)增具有NcoI和BstE II酶切位點(diǎn)的BraERF023a編碼區(qū)cDNA。將BraERF023a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-T1克隆載體連接（參照說明書），采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。利用NcoI-BraERF023a-F/BstE II-BraERF023a-R引物組合對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定（表 1），并進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。對(duì)含有BraERF023a正確序列的陽(yáng)性克隆及pCAMBIA3301表達(dá)載體分別進(jìn)行NcoI和BstE II雙酶切，回收酶切片段，利用T4 DNA連接酶將BraERF023a連接至 pCAMBIA3301載體的CaMV 35S啟動(dòng)子下游，篩選獲得 35S::BraERF023a重組表達(dá)載體。采用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用BraERF023a特異引物和組合引物（35S-F/BraERF023a-R）對(duì)農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行分子鑒定（表1）。將含有35S::BraERF023a重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌采用浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥。

表1 BraERF023a克隆、載體構(gòu)建和定量RT-PCR分析引物序列Table 1 Primers used for BraERF023a cloning, vector construction and qRT-PCR assay

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)BraERF023a過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥

于 250 mL液體 YEB培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)含有35S::BraERF023a重組質(zhì)粒的陽(yáng)性農(nóng)桿菌，使其OD600值約為1.2—1.6，5 500 r/min離心10 min收集菌體，用500 mL 5%的蔗糖溶液（含終濃度為0.05%的silwet L-77）重懸菌體，配成轉(zhuǎn)化液。于盛花期將擬南芥花序浸入轉(zhuǎn)化液中浸染30 s，用保鮮膜包好植株，平置于托盤中避光培養(yǎng)24 h，7 d后再次轉(zhuǎn)化，兩次轉(zhuǎn)化完成后將擬南芥置于培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)至種子成熟，收集種子，記為T0代。

1.8 BraERF023a過表達(dá)擬南芥的抗性篩選及鑒定

將春化后的BraERF023a轉(zhuǎn)基因T0代擬南芥種子種于營(yíng)養(yǎng)土中，待其長(zhǎng)出兩片真葉后，噴灑稀釋10 000倍的 Basta溶液，對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行抗性篩選。對(duì)篩選獲得的T0、T1、T2和T3代抗性轉(zhuǎn)化株進(jìn)一步提取其DNA，利用特異引物（BraERF023a-F/BraERF023a-R）和組合引物（35S-F/BraERF023a-R）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增（表1），檢測(cè)BraERF023a是否已整合到擬南芥基因組中。進(jìn)一步提取 T3代純合抗性轉(zhuǎn)化株RNA，以qBraERF023a-F/qBraERF023a-R為引物，采用qRT-PCR方法檢測(cè)BraERF023a在擬南芥轉(zhuǎn)化株中的表達(dá)特征，收獲純合的T3代轉(zhuǎn)化株種子用于后續(xù)分析。

1.9 BraERF023a過表達(dá)擬南芥的表型及抗性分析

將 T3代過表達(dá)BraERF023a擬南芥轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照種子同時(shí)播種，在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)其株高、莖粗、抽薹時(shí)間、分枝數(shù)目、果莢長(zhǎng)短等表型進(jìn)行觀察。此外，待過表達(dá)BraERF023a擬南芥轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照長(zhǎng)至3周時(shí)，在一次性澆足水后7 d，改為澆灌200 mmol·L-1NaCl溶液進(jìn)行為期3周的鹽脅迫處理，3周后觀察二者在鹽脅迫下的表型變化。對(duì)長(zhǎng)至3周的過表達(dá)BraERF023a擬南芥轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照在一次性澆足水后，停止?jié)菜⑦M(jìn)行為期20 d的干旱脅迫處理，之后復(fù)水，觀察復(fù)水10 d后二者的干旱脅迫表型并統(tǒng)計(jì)其存活率。

2 結(jié)果

2.1 BraERF023a的克隆及序列分析

分別以花椰菜DNA、cDNA為模板，利用特異性引物組合BraERF023a-F/BraERF023a-R擴(kuò)增BraERF023a的全長(zhǎng)編碼區(qū)（表 1）。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果表明，無(wú)論是以DNA還是cDNA為模板均能擴(kuò)增出一條約600 bp的特異條帶，其長(zhǎng)度與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的BraERF023a序列長(zhǎng)度一致，證實(shí)花椰菜BraERF023a序列中無(wú)內(nèi)含子。進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆及測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，BraERF023a編碼區(qū)全長(zhǎng)597 bp，預(yù)期編碼一個(gè)含有198個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖1）。序列分析發(fā)現(xiàn)，BraERF023a包含一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋，且保守結(jié)構(gòu)域中第14和19位氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸，均符合ERF轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征（圖1）。進(jìn)一步利用ProtFun 2.2 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）對(duì)BraERF023a的蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，BraERF023a可能主要在植物生長(zhǎng)發(fā)育及轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個(gè)過程中發(fā)揮作用。此外，序列比對(duì)及聚類分析結(jié)果顯示，BraERF023a與B.napus、B. oleracea、B. rapa等十字花科蕓薹屬其他植物中的ERF023序列具有較高相似性（大于90%），而與水稻、玉米、高粱等禾本科植物中的ERF023相似性較低，表明ERF023在十字花科蕓薹屬作物中具有較高保守性，其可能具有相似的功能。

2.2 BraERF023a在鹽脅迫和模擬干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征

200 mmol·L-1NaCl鹽處理?xiàng)l件下，BraERF023a的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，表明鹽脅迫處理可以顯著誘導(dǎo)BraERF023a的表達(dá)（圖2-a）。與其相似，在 20%的 PEG6000模擬干旱脅迫處理?xiàng)l件下，花椰菜中的BraERF023a在脅迫處理后不同時(shí)間段的表達(dá)量均顯著高于處理前（圖 2-b），表明BraERF023a不但正向響應(yīng)鹽脅迫，也受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 BraERF023a表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

分別采用基因特異引物（BraERF023a-F/BraERF023a-R）和組合引物（35S-F/BraERF023a-R）進(jìn)行菌液PCR，鑒定重組載體是否已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。隨機(jī)挑取6個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示在 6個(gè)陽(yáng)性克隆中均可檢測(cè)到長(zhǎng)度約為 600 bp和1 100 bp的特異性條帶（圖3-a），條帶大小均符合預(yù)期，表明 35S::BraERF023a過表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

2.4 BraERF023a過表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化株系篩選及分子鑒定

野生型擬南芥于盛花期經(jīng)農(nóng)桿菌浸花法侵染后培養(yǎng)至種子成熟，記為T0代，T0代種子萌發(fā)后進(jìn)行Basta抗性篩選。篩選結(jié)果顯示，絕大部分幼苗葉片逐漸黃化，26個(gè)植株生長(zhǎng)發(fā)育狀況正常，初步鑒定為抗性轉(zhuǎn)化株系。隨機(jī)選取其中 10個(gè)抗性轉(zhuǎn)化株系分別進(jìn)行DNA水平及轉(zhuǎn)錄水平的分子鑒定。以DNA為模板，采用BraERF023a特異引物及BraERF023a與載體序列組合引物分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，在其中5個(gè)株系中可以分別擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的約600 bp和1 100 bp的特異性條帶，表明BraERF023a已成功整合到這些株系的基因組中（圖3-b）。進(jìn)一步采用qRT-PCR方法對(duì)BraERF023a在這5個(gè)陽(yáng)性株系中的表達(dá)特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，BraERF023a在這 5個(gè)株系中的表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照（圖 3-c），證實(shí)BraERF023a不但成功整合到轉(zhuǎn)化株基因組內(nèi)，并且實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化株的高表達(dá)。將這5個(gè)T0代植株進(jìn)行多代自交純合，T3代株系用于后續(xù)分析。

2.5 BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

為揭示BraERF023a在擬南芥中過表達(dá)是否影響轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)基因擬南芥在正常生長(zhǎng)條件下不同生長(zhǎng)階段的表型特征進(jìn)行觀察、分析。結(jié)果顯示，幼苗生長(zhǎng)初期（3周以前），過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)基因擬南芥株系與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，但在幼苗生長(zhǎng)3周后，過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照（圖4）。待植株進(jìn)入成熟期，對(duì)其株高、分枝數(shù)目等表型特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系相對(duì)于對(duì)照植株表現(xiàn)為植株更高、分枝數(shù)目更多、花莖更粗，整體生物量增加。但二者花序大小及果莢長(zhǎng)度無(wú)明顯差異。在抽薹時(shí)間方面，過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系比對(duì)照滯后約一周（表2）。上述結(jié)果表明，在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a對(duì)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，其可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育，延長(zhǎng)其抽薹期，但對(duì)轉(zhuǎn)化株育性、結(jié)種量無(wú)顯著影響。

2.6 BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫分析

BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對(duì)照經(jīng)鹽脅迫后生長(zhǎng)均受到一定抑制。但對(duì)照組擬南芥葉片萎蔫黃化嚴(yán)重甚至全部枯萎，植株存活率低；而過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系葉片雖也發(fā)生黃化，但程度顯著低于對(duì)照（圖5），且盡管受到鹽脅迫，BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)化株植株最終的存活率（86%）顯著高于對(duì)照組（41%）。表明在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可以提高轉(zhuǎn)化株抵御鹽脅迫的能力。

2.7 BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫分析

干旱脅迫處理20 d后，BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)化株系和野生型植株均萎蔫嚴(yán)重，但野生型植株基本已全部萎蔫黃化至死亡，而BraERF023a過表達(dá)轉(zhuǎn)化株系萎蔫黃化程度相對(duì)野生型較輕，部分轉(zhuǎn)化株系葉片仍保持綠色（圖6）。對(duì)所有干旱處理植株進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水10 d后，其中2個(gè)過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系中（L8、L9）的大部分植株恢復(fù)生長(zhǎng)，而對(duì)照組絕大部分已枯萎（圖 6）。且過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)化株系的存活率顯著高于對(duì)照組（圖 7）。表明在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可以顯著提高轉(zhuǎn)化株的耐旱性。

3 討論

3.1 BraERF023a在植物中的分子進(jìn)化特征分析

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子最初在植物中被發(fā)現(xiàn)。1994年 JOFUKU等[4]從模式植物擬南芥中分離到第一個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子APETALA2，該轉(zhuǎn)錄因子與花發(fā)育和種子萌發(fā)有關(guān)。隨后AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員陸續(xù)從不同植物中被鑒定、克隆，并證實(shí)其為植物所特有?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明AP2/ERF家族成員均含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域[5]。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及序列特征，AP2/ERF家族中的ERF亞族和DREB亞族均含有單個(gè)的AP2結(jié)構(gòu)域[6]，但是AP2結(jié)構(gòu)域第14位和第19位氨基酸殘基在兩者中不同。ERF亞族成員AP2結(jié)構(gòu)域的第14位和19位分別為丙氨酸和天冬氨酸，而DREB亞族成員該結(jié)構(gòu)域第14位和19位分別為纈氨酸和谷氨酸[7]。通過對(duì)BraERF023a的序列分析發(fā)現(xiàn)，其具有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，并且保守結(jié)構(gòu)域第14位和19位分別為丙氨酸和天冬氨酸，符合ERF亞族成員的典型結(jié)構(gòu)特征，證實(shí)其為ERF轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證實(shí)ERF轉(zhuǎn)錄因子可與GCC盒（AGCCGCC）等下游靶基因的順式作用元件結(jié)合，從而在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用[9,22]。進(jìn)一步的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BraERF023a與雙子葉植物，特別是與花椰菜同屬于十字花科蕓薹屬的其他植物中的ERF023在進(jìn)化上具有較高保守性，而與單子葉植物中該轉(zhuǎn)錄因子的序列同源性較低，暗示BraERF023a在祖先植物進(jìn)化形成單子葉和雙子葉植物時(shí)，序列已發(fā)生分化，但其功能是否也發(fā)生了亞功能化，有待進(jìn)一步探究。在克隆并揭示BraERF023a序列及表達(dá)特征基礎(chǔ)上，通過遺傳轉(zhuǎn)化策略將其在花椰菜中進(jìn)行過表達(dá)，并分析過表達(dá)BraERF023a花椰菜轉(zhuǎn)化株系生長(zhǎng)發(fā)育及在逆境脅迫條件下的表型及生理特征，對(duì)于闡釋BraERF023a的功能具有重要價(jià)值。但花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化效率受材料基因型、遺傳背景等因素影響很大，不同基因型材料遺傳轉(zhuǎn)化效率普遍不高，很難在短期內(nèi)獲得轉(zhuǎn)化株系，即使獲得了轉(zhuǎn)化株系，很多轉(zhuǎn)化株系也不能正常結(jié)籽。因此，轉(zhuǎn)化效率低及結(jié)籽困難一直是花椰菜基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢的一個(gè)重要瓶頸?；诖?，本研究為探究花椰菜BraERF023a的功能，首先將其轉(zhuǎn)入到易于轉(zhuǎn)化的模式植物擬南芥中進(jìn)行功能分析。BraERF023a在花椰菜中過表達(dá)及采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除的工作正在進(jìn)行中。

表2 過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析Table 2 Phenotypic analysis of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis

3.2 BraERF023a響應(yīng)鹽和干旱脅迫分析

已有研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員主要在植物逆境響應(yīng)中發(fā)揮作用。但不同植物來源的ERF成員或同一植物中不同的ERF成員對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)特征不盡相同。JERF1在煙草中過表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)化株對(duì)低溫及高鹽的耐受[23]。擬南芥AtERF1的表達(dá)受ABA負(fù)調(diào)控，其過表達(dá)導(dǎo)致ABA積累和脯氨酸增加，進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)化株對(duì)干旱、高鹽和熱脅迫的耐受性[24]。過量表達(dá)MdERF72的蘋果愈傷組織在高鹽和低溫脅迫處理下，生長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于野生型對(duì)照，表明MdERF72在響應(yīng)高鹽、低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用[25]。苜蓿中 ERF轉(zhuǎn)錄因子MfERF1過表達(dá)可促進(jìn)轉(zhuǎn)化株多胺的合成與轉(zhuǎn)化，提高植株抗氧化能力和脯氨酸積累，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化株對(duì)低溫的耐受[26]。BOLT等[27]研究發(fā)現(xiàn)ERF105在擬南芥對(duì)凍害的耐受性中發(fā)揮重要作用，是擬南芥冷馴化中所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。ERF102和ERF103也被證實(shí)在擬南芥冷馴化中扮演重要角色[28]。有關(guān)花椰菜中ERF轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道很少。筆者課題組前期的研究表明，在花椰菜中至少存在146個(gè)ERF成員，這其中絕大部分成員的功能未知[21]。本研究結(jié)果表明，鹽及干旱逆境脅迫可顯著誘導(dǎo)花椰菜中BraERF023a的表達(dá)，暗示BraERF023a是一個(gè)鹽及干旱正向響應(yīng)應(yīng)答因子。進(jìn)一步的過表達(dá)功能分析表明，在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及干旱脅迫的耐受。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，BraERF023a在植物耐鹽及抗旱應(yīng)答中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。此外，前期研究結(jié)果表明花椰菜中除BraERF023a外，還具有一個(gè)BraERF023a的等位變異，命名為BraERF023b，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為567 bp，比BraERF023a少30 bp[21]。在花椰菜中BraERF023b是功能性冗余還是具有其他功能有待進(jìn)一步探究。目前，有關(guān)不同植物中ERF023的研究很少。在杏桃干旱脅迫響應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可誘導(dǎo)其內(nèi)PpERF023的表達(dá)，暗示PpERF023在干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[29]。杏桃ERF023在擬南芥中的同源基因AtHARDY被證實(shí)在提高植株的水分利用效率，提高對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力過程中發(fā)揮重要作用[30]。這暗示不同植物來源的ERF023在干旱脅迫應(yīng)答中可能發(fā)揮重要作用，但其是否也都參與鹽脅迫應(yīng)答并發(fā)揮作用有待進(jìn)一步探究。在葡萄中的研究表明，ERF023可能參與葡萄對(duì)病原菌的防御，其過表達(dá)在提高葡萄對(duì)灰霉病的抗性方面有一定作用[31]。暗示ERF023不但在非生物逆境脅迫中發(fā)揮作用，也響應(yīng)生物脅迫。因此，進(jìn)一步克隆不同植物中的ERF023，并揭示其對(duì)不同逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)于闡釋ERF類轉(zhuǎn)錄因子的功能具有重要意義。

3.3 BraERF023a在生長(zhǎng)發(fā)育中的功能分析

盡管大部分研究表明ERF類轉(zhuǎn)錄因子主要在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮作用。但也有研究表明一些ERF轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。如擬南芥中ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員TINY可抑制植物激素BR調(diào)控的生長(zhǎng)發(fā)育過程，同時(shí)也調(diào)控植株對(duì)干旱的脅迫反應(yīng)。TINY過表達(dá)可導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[32]。在水稻中ERF轉(zhuǎn)錄因子OsEATB可通過下調(diào)赤霉素生物合成基因限制節(jié)間伸長(zhǎng)，導(dǎo)致植株矮化[33]。NAKANO等[34]研究表明，番茄SlERF52在花梗離區(qū)特異表達(dá)，其在花梗脫落中發(fā)揮重要作用。過量表達(dá)擬南芥AtERF019不但可以提高植物的耐旱性，還可以延遲植株生長(zhǎng)和衰老[35]。在黃瓜中鑒定出 138個(gè)ERF家族成員，其中多個(gè)成員被認(rèn)為在雌花發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用[36]。本研究結(jié)果表明，正常生長(zhǎng)條件下，在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可使轉(zhuǎn)化株表現(xiàn)出顯著不同于野生型對(duì)照的生長(zhǎng)發(fā)育特征，如相對(duì)于野生型對(duì)照，過表達(dá)BraERF023a轉(zhuǎn)基因擬南芥植株更高，主莖加粗，蓮座和一級(jí)分枝數(shù)增多、生物量提高等，并且過表達(dá)轉(zhuǎn)化株的抽薹時(shí)間延長(zhǎng)，致使其生長(zhǎng)期延長(zhǎng)（表2、圖4）。該結(jié)果表明在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育，暗示BraERF023a不但是一個(gè)鹽及干旱脅迫響應(yīng)的正向調(diào)控因子，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過程中也可能發(fā)揮重要作用，有待對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探究。

4 結(jié)論

花椰菜BraERF023a含有一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，其與十字花科蕓薹屬植物中的ERF023具有較高序列同源性。轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征分析證實(shí)鹽及干旱脅迫可顯著誘導(dǎo)BraERF023a的表達(dá)。在擬南芥中過表達(dá)BraERF023a可促進(jìn)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育，并顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及干旱脅迫的耐受力。結(jié)果證實(shí)，BraERF023a在植物響應(yīng)鹽及干旱脅迫中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用，是一個(gè)優(yōu)質(zhì)耐鹽抗旱基因，在花椰菜抗逆分子育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值。