孫治坤 馬興榮 陳 帥 賀 爽 張杰文△

1)河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種逐漸進(jìn)展的退行性疾病，隨著患者年齡的增加其癥狀也會(huì)逐漸惡化，并最終影響患者的日常生活行為能力[1]，其發(fā)病率是所有老年性癡呆類型中最高的一種。2019阿爾茨海默病協(xié)會(huì)報(bào)告指出，目前美國的AD患者約580萬，預(yù)計(jì)到2050年，美國的AD患者將達(dá)到1 380萬[2]。由于AD的潛伏期較長(zhǎng)，研究認(rèn)為在AD患者出現(xiàn)癥狀前20 a或更長(zhǎng)的時(shí)間就開始出現(xiàn)腦部的一些病理變化，如出現(xiàn)大腦中參與思考、學(xué)習(xí)和記憶(認(rèn)知功能)的部分神經(jīng)元被破壞[3-4]，長(zhǎng)期的這些大腦病理變化逐漸導(dǎo)致患者出現(xiàn)臨床癥狀，如記憶力減退及言語障礙等，因此研究AD的發(fā)病機(jī)制，特別是早期的病理變化具有重要意義。但目前AD的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，主要與β-淀粉樣蛋白的沉積和降解障礙有關(guān)[5-6]，研究認(rèn)為Aβ的沉積和降解障礙導(dǎo)致Aβ的聚集，可誘發(fā)tau蛋白的超磷酸化、神經(jīng)元丟失及突觸傳遞功能障礙等一系列病理變化，最終導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)是調(diào)節(jié)線粒體生物合成及功能的核心因子[7-8]，具有調(diào)節(jié)能量代謝、氧化應(yīng)激和線粒體的生物合成等功能。PGC-1α在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)具有一定的組織特異性，主要存在于線粒體含量豐富的組織且對(duì)高能量需求較多的組織，如脂肪組織、骨骼肌、心臟、肝、腦及腎等組織。在鼠類腦組織中PGC-1α主要表達(dá)在皮質(zhì)、紋狀體、黑質(zhì)、丘腦、海馬和小腦的神經(jīng)元[9]，尤其在GABA能神經(jīng)元中表達(dá)較多，但在膠質(zhì)細(xì)胞中幾乎不存在[9-10]。由于PGC-1α在腦內(nèi)廣泛分布再加上它的生理功能，因此其與和氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙有關(guān)的一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如AD[11]、帕金森病[12]、亨廷頓病[13]等的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關(guān)性。既往研究[14-17]也證實(shí)了這一點(diǎn)，然而目前國內(nèi)外對(duì)PGC-1α在AD發(fā)病機(jī)制中作用的研究還處于起步與探索階段。既往研究表明PGC-1α基因與AD的發(fā)病有明顯相關(guān)性[16]，然而目前的研究尚不確定在整體實(shí)驗(yàn)中PGC-1α的降低或缺失對(duì)Aβ的神經(jīng)毒性作用有無影響，因此本研究采用PGC-1α基因缺失小鼠觀察Aβ對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能、腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)及氧化應(yīng)激等的影響，旨在為AD發(fā)病機(jī)制的研究提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組研究對(duì)象為健康的雄性PGC-1α基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠各12只，均來自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室，體質(zhì)量20～22 g，月齡8～12周，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后按照隨機(jī)原則將每種基因型組小鼠分為對(duì)照組和Aβ注射組，每組6只。

1．2Aβ的處理Aβ1-40購買(Sigma公司)后加入生理鹽水制成濃度為10 μg/μL的凝聚狀態(tài)，在-80 ℃的冰箱里保存待用，使用前1 d從冰箱里取出然后在37 ℃溫箱里孵育約24 h后使用。

1．3手術(shù)操作兩種基因的Aβ注射組小鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射進(jìn)行麻醉，小鼠顱骨用腦立體定位儀進(jìn)行固定，經(jīng)過備皮和消毒后，在頭顱的頂中線切開一約1 cm的切口，仔細(xì)分開皮下組織，暴露出前囟中心點(diǎn)，然后以該點(diǎn)作為一個(gè)新的基準(zhǔn)，在其后0.5 mm、中線旁1.0 mm處垂直進(jìn)針，使用牙科鉆鉆開顱骨，5 μL微量進(jìn)樣器向小鼠顱內(nèi)雙側(cè)側(cè)腦室慢慢注入1 μL凝聚態(tài)的Aβ1-40，留針約5 min后緩慢撤針，然后進(jìn)行皮膚的縫合和傷口的消毒等處理。兩種基因組的對(duì)照組小鼠在雙側(cè)側(cè)腦室里的注射物用等體積的生理鹽水代替凝聚態(tài)的Aβ1-40，其他手術(shù)步驟及手術(shù)條件均相同。手術(shù)完成4周后進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。

1．4行為學(xué)評(píng)估依照以前的實(shí)驗(yàn)方法[18-19]，Morris水迷宮設(shè)備來自中國醫(yī)科院，由3個(gè)部分組成：圓形的水池、攝像系統(tǒng)和分析系統(tǒng)。評(píng)估分為兩個(gè)部分：(1)定位航行測(cè)試：對(duì)小鼠進(jìn)行為期4 d的訓(xùn)練和測(cè)試。圓形水池的直徑120 cm，壁為黑色，水中添加黑色食用色素使水變?yōu)楹谏?0 cm，溫度維持在22 ℃左右，將水池平均劃分為4個(gè)象限，在第二個(gè)象限中放入一直徑約9 cm的黑色圓形小平臺(tái)，距離水面下1～2 cm。各組研究對(duì)象每天接受4次訓(xùn)練，每次180 s，每?jī)纱斡?xùn)練的間隔時(shí)間30 min，按隨機(jī)原則選擇每次訓(xùn)練的入水點(diǎn)，如果動(dòng)物相鄰2 d具有相同的入水順序，則重新進(jìn)行隨機(jī)化選擇。如果在訓(xùn)練時(shí)間內(nèi)小鼠能爬上平臺(tái)，則讓它在臺(tái)上停留30 s；如果小鼠不能發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，可把它指引到平臺(tái)上并停留30 s。用攝像頭追蹤小鼠的游泳軌跡，并輸入計(jì)算機(jī)中計(jì)算小鼠到達(dá)平臺(tái)前的時(shí)間(潛伏期)和游泳距離。(2)空間搜索測(cè)試：在測(cè)試的第5天把小平臺(tái)撤掉，然后隨機(jī)分兩次將小鼠放入水中，放入點(diǎn)為離原平臺(tái)位置較遠(yuǎn)的兩個(gè)象限，然后記錄并分析小鼠在原第二象限內(nèi)停留的時(shí)間和游泳距離占總游泳時(shí)間或總游泳距離的百分比。

1．5小鼠皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)活性的檢測(cè)依照之前的方法[18-19]，準(zhǔn)備好冰盤和預(yù)冷的PBS液，小鼠經(jīng)斷頭處死后，即刻剝離出腦組織，用預(yù)冷的PBS液沖刷干凈后放入冰盤，快速仔細(xì)地分離出雙側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織，在冰浴中分別加入等量的冰生理鹽水進(jìn)行勻漿，然后在4 ℃的離心機(jī)中以5 000 r/min的速度離心10 min后取上清液為待測(cè)樣品。檢測(cè)各指標(biāo)之前首先用BCA(購自Pierce公司，美國)法測(cè)定蛋白含量，然后按照試劑盒說明書檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)(ChAT及AchE試劑盒來自中國南京建成生物工程研究所；GSH試劑盒來自美國Cayman Chemical公司；MDA和SOD試劑盒購自中國賽默飛世爾科技有限公司)。

2 結(jié)果

2．1Aβ對(duì)不同基因組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2．1．1 定位航行測(cè)試：訓(xùn)練前3 d各組測(cè)試對(duì)象平均上臺(tái)前的潛伏期(第1天：F=0.813，P=0.457；第2天：F=1.369，P=0.277；第3天：F=1.436，P=0.261；圖1A)以及上臺(tái)前的游泳距離(第1天：F=0.297，P=0.83；第2天：F=0.565，P=0.645；第3天：F=0.725，P=0.549；圖1B)均無明顯差異。隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組測(cè)試對(duì)象找到平臺(tái)前所用時(shí)間及游泳距離均不斷縮短。但第4天時(shí)各組測(cè)試對(duì)象平均上臺(tái)前的潛伏期(F=16.464，P=0.000)及上臺(tái)前的游泳距離(F=47.121，P=0.000)均出現(xiàn)明顯差異，與同種基因小鼠的對(duì)照組相比，兩種基因Aβ注射組小鼠的平均上臺(tái)前所用時(shí)間(正常基因Aβ組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖1A)和游泳的距離(正?；駻β組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖1B)均明顯增高，且PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組的平均上臺(tái)前所用時(shí)間(P=0.004，圖1A)和游泳的距離(P=0.003，圖1B)均明顯高于正?；蛐∈笞⑸銩β組。

2．1．2 空間搜索試驗(yàn)：平臺(tái)被撤除后各組測(cè)試對(duì)象在平臺(tái)所在象限中游泳的時(shí)間百分比(F=62.078，P=0.000)和距離百分比(F=56.907，P=0.000)均出現(xiàn)明顯差異。與同種基因小鼠的對(duì)照組相比，兩種基因Aβ注射組動(dòng)物在平臺(tái)所在象限中游泳的時(shí)間百分比(正?；駻β組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖2A)和距離百分比(正?；駻β組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖2B)均明顯降低，而PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組在平臺(tái)所在象限中游泳的時(shí)間百分比(P=0.000，圖2A)和距離百分比(P=0.000，圖2B)明顯低于正?；蛐∈笞⑸銩β組。

圖1 Aβ對(duì)不同基因組小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的作用 A：平均上臺(tái)前各組小鼠的時(shí)間(潛伏期)；B：平均上臺(tái)前各組小鼠游泳的距離(與同種基因?qū)φ战M比較，*P<0.05；與正?；駻β組比較，#P<0.05)Figure 1 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.The Morris water maze was used to evaluate the spatial learning and memory ability by measuring escape latency (A) and escape distances (B).*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

圖2 Aβ對(duì)不同基因組小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的作用 A：平臺(tái)被撤除后各組小鼠在原來平臺(tái)所在象限中游泳的時(shí)間百分比；B：平臺(tái)被撤除后各組小鼠在原來平臺(tái)所在象限中游泳的距離百分比(與同種基因?qū)φ战M比較，*P<0.05；與正常基因Aβ組比較，#P<0.05)Figure 2 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.A probe test was used to analyze maintenance of memory in the Morris water maze by measuring the percentage of time spent (A) and swimming distance percentage (B) in the target quadrant．*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

2．2Aβ對(duì)不同基因組小鼠皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)ChAT和AchE活性的影響各組小鼠皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)ChAT和AchE活性的變化均出現(xiàn)明顯差異(表1)。與同種基因組的對(duì)照組相比，兩種不同基因小鼠注射Aβ組動(dòng)物腦皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)的ChAT活性均明顯降低(腦皮質(zhì)：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)，而AchE的活性卻明顯升高(腦皮質(zhì)：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)；與正?；蛐∈笞⑸銩β組相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組腦皮質(zhì)及海馬組織內(nèi)ChAT活性明顯降低(腦皮質(zhì)：P=0.001；海馬：P=0.02)，而AchE的活性明顯升高(腦皮質(zhì)：P=0.000；海馬：P=0.011)。見表1。

表1 Aβ對(duì)不同基因組小鼠皮質(zhì)、海馬ChAT和AchE活性的作用Table 1 Effect of beta-amyloid on the ChAT and AchE activity in cortex and

2．3Aβ對(duì)不同基因組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子(SOD、GSH及MDA)活性的影響各組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子的變化均出現(xiàn)明顯差異(表2)。與同種基因組的對(duì)照組相比，兩種不同基因Aβ注射組動(dòng)物大腦皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)的SOD(腦皮質(zhì)：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)及GSH(腦皮質(zhì)：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)的活性均明顯降低(P<0.05)，而MDA的活性卻明顯升高(腦皮質(zhì)：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正?；駻β組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)；與正?；蛐∈笞⑸銩β組動(dòng)物相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組動(dòng)物的大腦皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)SOD(腦皮質(zhì)：P=0.027；海馬：P=0.001)及GSH(腦皮質(zhì)：P=0.000；海馬：P=0.014)的活性均明顯降低，而MDA的活性則明顯升高(腦皮質(zhì)：P=0.000；海馬：P=0.000)。見表2。

表2 Aβ對(duì)不同基因組小鼠皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)SOD、GSH及MDA活性的作用Table 2 Effect of beta-amyloid on the SOD，GSH and MDA activity in cortex and

3 討論

PGC-1α是一種輔助激活核受體PPARγ的激活因子，該名字由其功能而來，在調(diào)節(jié)線粒體的功能和生物合成過程中具有重要作用[20-21]。既往研究表明其與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關(guān)性，如在帕金森病的研究中，ZHENG等[22]用全基因組的Meta分析發(fā)現(xiàn)帕金森病患者中PGC-1α及其調(diào)控的下游基因表達(dá)下降。WANG等[23]研究認(rèn)為PGC-1α的過表達(dá)可保護(hù)MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠帕金森病模型的行為障礙及黑質(zhì)中線粒體功能障礙[23]。SUN等[24]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α基因敲除小鼠可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙及多巴胺神經(jīng)元的丟失。對(duì)亨廷頓病的研究也發(fā)現(xiàn)，在亨廷頓病患者及動(dòng)物模型的紋狀體中均發(fā)現(xiàn)PGC-1α表達(dá)的降低[25-26]，在亨廷頓病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中β-拉帕酮可通過調(diào)節(jié)PGC-1α的活性而改善小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙及線粒體功能的損傷[27]。然而目前對(duì)PGC-1α在AD發(fā)病機(jī)制中作用的研究還處于起步與探索階段。

QIN等[28]利用全基因組微陣列分析的研究證明了PGC-1α在AD患者腦中RNA的表達(dá)隨著AD患者癡呆病情的進(jìn)展而顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PGC-1α的蛋白含量與老年斑的病理學(xué)及腦內(nèi)Aβ的含量呈負(fù)相關(guān)。KATSOURI等[29]利用病毒載體將PGC-1α注入APP23轉(zhuǎn)基因鼠AD模型的腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)，注射PGC-1α的小鼠可通過減少β分泌酶的表達(dá)而減少Aβ斑塊的產(chǎn)生，保護(hù)了大腦中的神經(jīng)元凋亡。然而DUMONT等[30]的研究則給出了不同結(jié)論，其研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α的過度表達(dá)可通過誘導(dǎo)線粒體異常、神經(jīng)細(xì)胞死亡和行為亢進(jìn)加劇Tg19959轉(zhuǎn)基因小鼠的APP基因突變及與人類AD相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)缺陷。在細(xì)胞水平的研究上，ZHANG等[31]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路保護(hù)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，然而目前的研究尚不確定整體實(shí)驗(yàn)中PGC-1α的降低或缺失對(duì)Aβ的神經(jīng)毒性作用有無促進(jìn)作用，因此本研究首次采用PGC-1α基因敲除小鼠整體水平上來研究PGC-1α對(duì)Aβ神經(jīng)毒性作用，旨在為研究AD的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)及新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α基因敲除小鼠與正常基因小鼠的側(cè)腦室注射入Aβ1-40后，PGC-1α基因敲除小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能較正常基因小鼠明顯減退，結(jié)合中樞膽堿能系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ后較正?；蛐∈笞⑸銩β后腦內(nèi)ChAT的活性明顯下降而AchE活性明顯升高。既往研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與阿爾茨海默病的發(fā)病密切相關(guān)[32-34]，在AD發(fā)病過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要作用，Aβ的聚集會(huì)將會(huì)導(dǎo)致大量活性氧自由基的產(chǎn)生，活性氧自由基可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)，生成的過氧化脂質(zhì)體(如丙二醛等)可以進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜蛋白的生理功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能的喪失及代謝紊亂，引起患者臨床上學(xué)習(xí)認(rèn)知及記憶功能的明顯下降[35-36]。大量產(chǎn)生的氧自由基又反過來干擾Aβ的降解，促進(jìn)Aβ的聚集[37]。線粒體可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化-還原狀態(tài)，它是體內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生的主要部位[38]。研究表明PGC-1α在調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激的過程中可直接調(diào)節(jié)多種抗氧化因子的表達(dá)，如錳超氧化物歧化酶、過氧化物酶3和5、過氧化氫酶、硫氧還蛋白2、解偶聯(lián)蛋白2和硫氧還蛋白還原酶等，從而防止氧化損傷和線粒體功能障礙[39-41]。本研究通過檢測(cè)各組動(dòng)物腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組較正?；蛐∈笞⑸銩β組腦內(nèi)SOD及GSH的活性明顯降低，而MDA的活性則明顯升高，提示PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。

本研究利用PGC-1α基因敲除小鼠從整體水平研究了PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40誘導(dǎo)的小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其作用是通過膽堿能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)失衡及加重氧化應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)的，本研究為深入探討AD發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路及理論基礎(chǔ)。