李 杰，蔡嘉慧，王慧中，孟一君

(1. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 311121； 2. 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 311121)

1 藥用植物相關簡介

藥用植物指的是能夠預防、治療疾病并對人體有保健養(yǎng)護功能的植物.在人類與疾病作斗爭的長期過程中，藥用植物扮演著至關重要的角色，其在民間醫(yī)學中已使用了至少4 500年.從大約200年前開始，化學家們先后致力于從植物、真菌和細菌中分離具有生物和藥理活性的物質(zhì)，并進一步制成純化合物.至今，大約有32 000個化合物來源于中藥，包括抗瘧藥青蒿素.而在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物數(shù)量中，有3/4是從植物中分離而來的，表明了植物對次級代謝產(chǎn)物的巨大貢獻.因此，藥用植物不僅是不斷積累并保存下來的寶貴財富，也是未來藥物研發(fā)和創(chuàng)新的重要源泉.而從古至今，原材料缺乏一直是廣泛應用藥用植物活性成分的最大阻礙.如：提取1 kg天然抗癌藥物紫杉醇需要3 000棵紅豆杉，也就是說每個病人每一療程大約需要6棵紅豆杉，而一棵紅豆杉至少需種植3年以上才能提取紫杉醇；5～6 kg的純長春新堿足以治療美國一年份所有的癌癥患者，而這些二聚生物堿在植物組織中大約占1 μg/g.據(jù)估計，中國每年需要200萬磅新鮮長春花產(chǎn)生大約25萬磅長春花干葉以供應國內(nèi)醫(yī)療所需起始物料.雖然相關藥用植物的人工栽培優(yōu)化研究也不斷有所突破，但對于方案優(yōu)化的研究仍是集中在資源調(diào)查、形態(tài)識別、人工栽培、藥性、藥效分析、化學物質(zhì)基礎揭示等方面，而對藥用植物基因資源的認識則相對薄弱，使得藥用植物學和現(xiàn)代生命科學缺乏溝通橋梁.

針對有重大經(jīng)濟價值的藥用植物進行全基因組測序及功能基因組研究，能夠推動藥用植物資源化、標準化、大數(shù)據(jù)化、科學化及國際化.關于藥用植物基因組測序的必要性主要體現(xiàn)在：1)藥用植物資源收集所需年份較長并具有道地性，對周圍的生長環(huán)境具有特定的要求.同種藥材因其產(chǎn)地的地理位置、氣候、自然條件的不同，尤其是土壤的理化性質(zhì)、微量元素含量不相同，其藥效、藥性存在顯著差異.通過研究藥用植物各組學之間的關系，形成以精準藥效研究為目標的種質(zhì)資源大數(shù)據(jù)中心，從而能夠廣泛運用于藥用模式生物研究、闡明道地藥材形成機制、基因組輔助育種、基因資源保護和利用、中藥質(zhì)量評價和控制、中藥新藥研發(fā)等領域；2)對藥用植物的理論研究不夠深入，無法預估還有多少天然產(chǎn)物未被發(fā)現(xiàn).但是，隨著更多植物基因組被測序，也許能夠給出更準確的數(shù)值；3)超過半數(shù)已知的藥用植物活性成分仍然無法被人工合成.在細菌與真菌中，生物合成基因通常是緊密成簇的.但植物中一個完整代謝途徑所涉及的基因卻是分散在整個基因組中的，這就使得藥用植物生物合成途徑和重構變得極為困難.因此，通過基因組信息和算法定義出完整的集合這一方法具有巨大的潛力.

本文將簡要概括目前已測序的藥用植物并對其中較有代表性的藥用植物基因組結(jié)構及功能基因挖掘進展進行詳細的描述，以探究藥用植物基因組結(jié)構特點及功能基因在調(diào)控植物生長、活性成分合成和抗逆境生長中所起的重要作用.

2 藥用植物基因組測序進展

2010年6月20日，中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所與廣藥集團在京舉行了丹參基因組框架圖成果發(fā)布會[1].這是世界上首個藥用植物基因組框架圖，標志著中藥研究進入了基因組學時代.2011年中，共有5種藥用植物基因組被測序，而隨著測序技術和關注度的不斷提高，2018年被測序的藥用植物已經(jīng)達到了18種.目前，總計有43種藥用植物的基因組相繼被測出，共涉及31個科.所用到的技術手段主要為Illumina、Roche454和PacBio等.其中，除銀杏外，買麻藤的基因組最大，為4.07 Gb，其次為人參(3.43 Gb).而有的藥用植物基因組非常小，如蟲草和靈芝等類，均小于40 Mb.其中最小為廣東蟲草，僅有29.05 Mb.個別藥用植物基因組研究文獻有多篇，如大麻、木豆、蛹蟲草、長春花、人參、靈芝等，能夠提供更多的參考；對于同種藥用植物而言，基因組的組裝結(jié)果也存在差異，這主要是因不同研究報告所涉及的組裝方法以及物種的產(chǎn)地不同而導致[2-11]；大部分文獻都對藥用植物重要活性成分相關的基因家族及代謝通路進行了深入研究，如作為傳統(tǒng)抗菌藥物，博落回能夠產(chǎn)生具有高水平抗微生物活性的芐基異喹啉生物堿(BIA)，例如血根堿(SAN)和白屈菜赤堿(CHE).而基于基因組學數(shù)據(jù)，能夠?qū)AN和CHE生物合成的16個代謝基因的完整集合進行檢索，并驗證其生化活性，從而最終將保守的BIA代謝途徑完整地梳理出來[12]；廣藿香油是廣藿香中主要的藥用成分，同時也是一種定香性能優(yōu)越的天然香料.對萜烯合酶(TPS)基因家族中268個TPS基因位點的鑒定，揭示了基因擴張所導致的a型TPS基因的高度特異化以及其在廣藿香油代謝途徑中所起的重要作用[13]；作為有效抗瘧疾化合物青蒿素的唯一天然來源，黃花蒿的基因組測序帶來了許多不曾預料到的結(jié)果：根據(jù)表達模式，MYB家族TF、AaMYB2基因與青蒿素生物合成特異性基因緊密聚集，而在此之前，并不清楚該轉(zhuǎn)錄因子家族與青蒿素生物合成有關；50%的核苷酸序列同一性表明黃花蒿基因組中的兩個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶(HMGR)來自不同的基因，而在之前的研究報道中它們卻被認定為是兩個等位基因；基因組結(jié)構分析表明，存在多個酶促步驟在限制青蒿素生物合成的代謝流量，因此，通過同時過表達青蒿素生物合成途徑上游(HMGR)、中游(FPS)和下游(DBR2)的多個基因，最終獲得了青蒿素含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因黃花蒿品系[14].

在進行藥用植物基因組測序時，也離不開各種數(shù)據(jù)庫及生物信息學軟件的比較分析.主要的綜合基因組數(shù)據(jù)庫有Assembly(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/)、CNGB(https://db.cngb.org/)、GigaDB(http://gigadb.org/)等；針對于植物的基因組數(shù)據(jù)庫包括EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)、JGI-Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)、PlantGDB(http://www.plantgdb.org/)等；更為細化專一的數(shù)據(jù)庫包括ChloroplastDB(植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫:http://chloroplast.cbio.psu.edu/)、HarvEST(作物EST序列數(shù)據(jù)庫:http://harvest.ucr.edu/)、PlantCARE(植物調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫:http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)、PlantTFDB(植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫:http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)、BAR(植物生物學分析工具平臺:http://www.bar.utoronto.ca/welcome.htm)等.藥用植物基因組生物信息學分析軟件主要分為7類：1)BLAST套件[15]；2)基因組測序，LSC[16]、SOAPfilter[17]、Skewer[18]等；3)基因組組裝以及質(zhì)量評估，SOAPdenovo[17]、CEGMA[19]、BUSCO[20]等；4)重復序列檢測，RepeatModeler[21]、TRF[22]、EMBOSS[23]等；5)基因預測和注釋，SNAP[24]、GENEWISE[25]、Pfam[26]等；6)基因家族鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，OrthoMCL[27]、MEGA[28]、ProtTest[29]等；7)轉(zhuǎn)錄組測序和分析，Trinity[30]、TopHat[31]、gCLUTO[32]等.

接下來，本文將詳細描述其中一些藥用植物(鐵皮石斛、人參、天麻、紅景天、靈芝)基因組測序的研究進展.其中涉及主要技術手段、蛋白編碼基因、重復序列、功能基因家族和信號調(diào)控網(wǎng)絡等關鍵信息.

3 代表性藥用植物基因組研究

3.1 鐵皮石斛基因組測序研究進展

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的物種，內(nèi)含多糖、茋類、聯(lián)芐類、生物堿類等化學成分，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、減輕肝損傷、降血糖等功效.其巨大的藥用價值、科學價值和商業(yè)價值掀起了相關研究熱潮.Yan等[33]結(jié)合Illumina Hiseq 2000平臺的二代測序技術(SGS)和PacBio平臺的三代測序技術(TGS)首次從頭組裝得到了1.35 Gb的鐵皮石斛全基因組序列.結(jié)果覆蓋94%的全基因組和91.5%的基因編碼區(qū)，鑒定出的蛋白編碼基因共有35 567個，其中97.56%被注釋.鑒定到的RNA包括396個rRNA、545個tRNA、16個sRNA、89個snRNA和1 005個microRNA；Zhang等[34]利用二代測序技術和SOAPdenovo2/Platanus組裝得到的鐵皮石斛全基因組序列大小為1.01 Gb.

以上研究中，重點提及的內(nèi)容有較多共同之處，如都提及了重復序列在整個基因組中的占比極大，其進一步的鑒定注釋結(jié)果也均表明其中很大一部分為轉(zhuǎn)座元件.此外，大量基因家族存在擴張現(xiàn)象，主要體現(xiàn)包括：與真菌共生和抗旱性相關的基因、涉及葡甘露聚糖合酶活性的基因、參與發(fā)育和生長調(diào)控的MADS-box基因.這些基因的大量重復解釋了鐵皮石斛能夠適應多變的環(huán)境而具有的強大免疫系統(tǒng)以及其藥用多糖的生物合成分子機制.全面的基因組結(jié)構解析還表明，次生代謝產(chǎn)物16-epelloellosimine是由生物堿合成途徑進一步生成而來、鐵皮石斛具有完整的花序基因集以及胚乳種子丟失可能是由于I型MADS-box基因家族成員的缺失所導致的.

3.2 人參基因組測序研究進展

作為我國傳統(tǒng)名貴藥材，人參(PanaxginsengC. A. Mey)享有“百草之王”的美譽，共有48條染色體(2n=4x=48)[35].人參基因組數(shù)據(jù)的收集和進一步完善能極大促進人參基礎研究和產(chǎn)業(yè)的開發(fā).Xu等[36]利用二代測序技術對4年生人參(株系IR826)進行全基因組測序.組裝后的基因組大小為3.5 Gb.總共預測到42 006個編碼蛋白質(zhì)的基因模型；Kim等[37]在Illumina平臺上通過全基因組鳥槍法策略對名為ChP型的人參進行了從頭基因組組裝，得到的基因組大小為2.98 Gb，注釋基因共59 352個.

以上研究表明，人參基因組中的重復序列高達60%以上，為所有已測序的被子植物中最高.而串聯(lián)重復也使得UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)基因擴增和分化至225個，這也進一步解釋了人參皂甙的多樣性；在與甲羥戊酸途徑(MVA)相關的31個基因中有8個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶特異性表達；重測序數(shù)據(jù)還顯示，南亞的二倍體人參品種的分化與全球變暖有關，而北美的兩種新品系的形成則是由兩次洲際遷徙進化而來.

3.3 天麻基因組測序研究進展

據(jù)中華人民共和國藥典所記,天麻(GastrodiaelataBl.)干燥塊莖可入藥,是中國名貴中藥材,性甘、平,歸肝經(jīng),有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡等功效,可用于小兒驚風、頭痛眩暈、肢體麻木等癥狀.Yuan等[38]利用全基因組測序(WGS)技術確定了天麻基因組大小為1.06 Gb，包含18 969個蛋白編碼基因.由于假基因化和基因組重排現(xiàn)象，天麻經(jīng)歷了廣泛的基因缺失事件.與另外兩種蘭科植物(桃紅蝴蝶蘭、鐵皮石斛)相比，天麻基因組上有3 586個基因家族收縮了.其中甚至包括一些在其他植物物種中具有保守性的基因，BUSCO分析表明，195(20.4%)個高保守的基因在天麻基因組中丟失了.此外，由于不需要進行光合作用，天麻的質(zhì)體基因組也收縮至35 326 bp并具有明顯重組現(xiàn)象，其中編碼光合復合體蛋白(NEP)的基因只保留有12個.但是，糖苷水解酶、尿素酶、ATPase等多個基因家族卻發(fā)生了擴張的現(xiàn)象，尤其是天麻的線粒體基因組的大小顯著擴大為1 339 kb.這些結(jié)果可能都是其因適應完全異養(yǎng)生活方式而導致的，這也暗示了完全異養(yǎng)植物的基因組具有較大的可塑性.

3.4 紅景天基因組測序研究進展

紅景天(Rhodiolacrenulata(HK. f. et.Thoms)H. Ohba)是景天科多年生草本開花植物，主要生長在亞北極地區(qū)的涼爽氣候環(huán)境中，如北美、北歐和中歐以及中國的西南和西北山區(qū).通常，紅景天屬具有相似的形態(tài)，導致其在分類學的鑒定和分類中具有一定的困難[39].盡管許多紅景天屬品種已長期被用作傳統(tǒng)藥物，其中一些還被廣泛用于心血管疾病、低壓缺氧、微生物感染、腫瘤和肌肉無力的治療中，但其確切的藥理作用機理仍不清楚[40-41].Fu等[42]在Illumina HiSeq 2000/4000平臺上利用WGS技術測序得到了第一張屬于紅景天屬的大紅花景天的基因組草圖.進一步對基因組進行高質(zhì)量組裝后，得到的大小為344.5 Mb.據(jù)k-mer分析，其基因組不僅高度雜合，而且高度重復，比率分別為1.12%和66.15%.此外，共檢測到226.6 Mb的轉(zhuǎn)座因子，其中77.03%為長末端重復序列.總共鑒定到31 517個蛋白編碼基因，BUSCO分析表明，其中86.72%被預測為植物基因.此外，有79.73%的蛋白編碼基因在功能上有注釋.草圖的完成有助于理解抗逆基因的進化機制以及不同藥物成分(例如紅景天中的紅景天苷)的生物合成途徑.

3.5 靈芝基因組測序研究進展

靈芝(GanodermalucidumKarst)也被稱為“不朽的蘑菇”和“中藥的象征”，是世界上最著名的藥用大型真菌之一.正如《美國草藥藥典》和《治療綱要》[43]所示，它的藥理活性已得到廣泛認可.現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有多種治療活性，包括抗腫瘤、抗高血壓、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性[44].靈芝含有大量不同的生物活性化合物，目前已鑒定出的就有400多種[45]，這使得這種真菌成為生物學上具有能夠生產(chǎn)化合物功能的模擬細胞“工廠”.而其中最主要的兩種藥理活性化合物就是三萜和多糖.除了產(chǎn)生這些生物活性化合物外，靈芝還像其他白色腐爛擔子菌一樣，會分泌能夠有效分解纖維素和木質(zhì)素的酶.這種酶的活性可能對生物質(zhì)利用、纖維漂白和有機污染物降解有幫助[46].

Chen等[47]利用二代測序技術和光學繪制法對單倍體核細胞的靈芝菌株260125-1進行了全基因組測序，組裝后得到的基因組大小為43.3 Mb，預測編碼基因有16 113個.Liu等[48]在Illumina Hiseq 2000 Sequencer平臺上采用全基因組鳥槍法策略對靈芝進行全基因組測序，經(jīng)SOAPdenovo最終組裝得到的基因組大小為39.9 Mb，注釋蛋白編碼基因12 080個；Binder等[49]在對多孔菌目進行系統(tǒng)發(fā)育分析和概述時，也對靈芝進行了全基因組測序，大小為39.52 Mb，篩選出的基因有12 910個；Zhou等[50]通過Roche公司的454超高通量測序技術對靈芝菌株G0119進行全基因組測序，最終由Illumina Solexa GAIIx組裝，得到了大小為41.49 Mb的基因組，并篩選出11 123個基因.

研究發(fā)現(xiàn)，在基因組水平上，靈芝的萜類生物合成僅通過MVA途徑，而不是MEP途徑.而從基因組結(jié)構來看，靈芝基因組中的轉(zhuǎn)座元件相對于其他已報道的真菌來說要少得多，只占基因組的4.6%.對于基因家族的研究主要集中于CYP基因，在24個CYP基因簇中發(fā)現(xiàn)了78個與羊毛甾醇合酶共表達的CYP基因，其中與靈芝酸(GA)生物合成相關的CYP基因有222個.可能是基因橫向轉(zhuǎn)移的結(jié)果抑或是基因自身具有迅速分化并伴隨新功能化的能力，靈芝中的CYP基因家族存在著大量擴張和新家族產(chǎn)生的現(xiàn)象，這也就導致了在所有已測序的真菌中，靈芝基因組中所含的CYP基因的多樣性和豐富度是最高的.此外，值得注意的是，除涉及三萜類和多糖生物合成的基因外，還發(fā)現(xiàn)某些基因可能參與了非核糖體多肽(NRP)、聚酮(PK)和其他種類萜烯的生物合成，而這些化合物之前卻從未從靈芝中分離得到，這表明其合成可能受到嚴格調(diào)控.由此可見，基因組的分析使我們進一步地了解生物體整體的化學特征，這對于研究藥物的合成途徑以及所產(chǎn)生的藥理活性都具有極大的幫助.

4 代表性藥用植物功能基因組研究進展

4.1 鐵皮石斛

鐵皮石斛中含有許多的活性成分，如多糖、生物堿、酚類、芪類、氨基酸等.多糖作為主要成分之一，與鐵皮石斛的藥理活性也有著緊密聯(lián)系.因此，目前判斷鐵皮石斛質(zhì)量的主要根據(jù)就是其多糖含量的多少.進一步研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛中占主導地位的多糖是含甘露糖的多糖(MCP).在MCP的生物合成過程中，GDP-甘露糖轉(zhuǎn)運蛋白(GMT)的存在是必不可少的，它能夠?qū)DP-甘露糖轉(zhuǎn)運至高爾基體腔中.Yu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，MCP具有多個亞型并且存在于多個不同的生理階段.他們從鐵皮石斛中鑒定出了3個GMT基因，命名為DoGMT1-3.蛋白序列分析表明DoGMT1、DoGMT2和DoGMT3均屬于NST超家族.通常情況下，植物合成多糖時需要NST超家族的參與，它們將糖核苷酸從細胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到高爾基體腔中.亞細胞定位和液體閃爍分析表明這3種DoGMT蛋白都靶向高爾基體.采用qRT-PCR和半qRT-PCR進行基因表達分析，發(fā)現(xiàn)甘露糖的積累與DoGMT1-3基因的轉(zhuǎn)錄水平是呈正相關的，在莖中這3個基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，而鐵皮石斛中儲存MCP的器官則正是莖.在圓球莖到幼苗這一系列生長階段中，3個基因的表達都有明顯的上調(diào)，而這也與相同階段中水溶性多糖(WSP)含量的逐漸增加相對應.這些發(fā)現(xiàn)都表明了鐵皮石斛中GMT基因在MCP生物合成中的重要性；除GMT基因外，GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因也參與了MCP的生物合成，GMP催化GDP-甘露糖的形成，而后者則作為合成MCP所需的供體.基于已測內(nèi)部轉(zhuǎn)錄組參考數(shù)據(jù)庫的基因注釋，2017年He等[52]鑒定出了3個GMP基因(DoGMP1-3).研究著重于DoGMP1基因的功能解析，與野生型相比，從DoGMP1轉(zhuǎn)基因擬南芥品系1、2、3中提取到的MCP含量要高出很多，分別增加了67%、96%和92%.熒光標記技術顯示DoGMP1蛋白位于細胞質(zhì)中，ClustalX2序列比對分析表明，來自鐵皮石斛和水稻的所有GMP蛋白均顯示出多種序列/結(jié)構相似性關系.為了研究可能存在的非生物脅迫耐受性，用150 mM NaCl處理，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因品系種子的萌發(fā)率要高于野生型種子，而且種子的生長情況也優(yōu)于野生型.以上的結(jié)果證明了GMP基因參與了MCP的生物合成，以及在種子發(fā)芽和幼苗生長期間，GMP基因在對鹽脅迫響應中所起的介導作用.He等[53]還通過RACE法從鐵皮石斛中克隆得到了磷酸甘露糖變位酶(PMM)基因的cDNA.PMM能夠催化6-磷酸甘露糖和1-磷酸甘露糖之間的相互轉(zhuǎn)化，而1-磷酸甘露糖則又是GDP-甘露糖的前體.一系列的遺傳研究證據(jù)證明PMM基因參與了總抗壞血酸(AsA)和多糖的生物合成并在非生物脅迫耐受性中起介導作用.此外， Yu等[54]利用生物信息學序列分析最終從鐵皮石斛基因組中確定了13種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(DoGALT1-13).系統(tǒng)發(fā)育分析和基因表達分析表明它們參與了β-1,3-半乳糖結(jié)合多糖的生物合成，且均屬于CAZY GT31家族.對DoGALT2的研究表明，其對于鐵皮石斛柱頭黏液的積累至關重要，并可能參與了鐵皮石斛花粉發(fā)育過程中含半乳糖多糖的生物合成調(diào)控.

對于如何增強作物品種脅迫耐受性而言，發(fā)展脅迫耐受性植物的基因工程可能是一個有效捷徑.因此，在建立于擬南芥和水稻的胚胎發(fā)育晚期豐富(LEA)完整蛋白質(zhì)組的親緣關系基礎上，Ling等[55]對鐵皮石斛的LEA基因家族進行了首次全面調(diào)查，共鑒定出17種鐵皮石斛LEA(DofLEA)的編碼基因.根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白質(zhì)基序分析以及qPCR結(jié)果表明，鐵皮石斛中的LEA蛋白是一個大家族，有多種序列、基序組成、染色體位置和表達模式.而在鹽和熱脅迫下，分別有6個和7個DofLEA的表達能夠使大腸桿菌的生長狀況改善.而根據(jù)qPCR數(shù)據(jù)，暴露于鹽和熱脅迫后，所有這些基因在各種組織中的表達均上調(diào).Zhang等[56]則研究鑒定出了8個鐵皮石斛中的PLP_deC(II型磷酸吡哆醛依賴性脫羧酶)基因.對基因結(jié)構分析表明，PLP_deC基因家族中外顯子的數(shù)量在進化過程中增加或減少，以此為同源PLP_deC基因之間的功能差異提供了基礎.而對保守基序的研究發(fā)現(xiàn)，同一亞科中的大多數(shù)PLP_deC基因具有高度相似的基序，這一點進一步支持了它們緊密的進化關系以及所構建的系統(tǒng)樹的可靠性.對各組織的基因表達譜進行的計算機模擬分析表明，高表達水平的PLP_deC基因可能參與了鐵皮石斛的組織生長和分化.此外，還發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的PLP_deC基因?qū)Ψ巧锩{迫(例如MeJA、ABA和SA脅迫)有反應.

4.2 人參

人參是對人類健康和醫(yī)學最重要的草藥之一，而其中的主要活性成分人參皂苷被認為是有極大應用前景的高價值藥用化合物.原人參二醇作為人參皂苷達瑪烷型的糖苷配基前體，包含了最多種類的人參皂苷(如人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD).它能夠通過不同的糖基轉(zhuǎn)移酶而轉(zhuǎn)變成人參皂苷.而原人參二醇的生物合成離不開細胞色素p450原人參二醇合成酶(PPDS)的參與.PPDS又被命名為CYP716A47，是CYP基因超家族的一員.Zhao等[57]將PPDS導入釀酒酵母中以建立更加優(yōu)化的原人參二醇人工生物合成途徑.他們通過跨膜結(jié)構域截斷以及自給自足的PPDS-ATR1融合結(jié)構對PPDS進行了改進.結(jié)果表明，融合酶的催化活性提高了約4.5倍，原人參二醇的產(chǎn)量提高了71.1%.體內(nèi)實驗表明，帶有融合蛋白的工程酵母有效地將96.8%的達瑪烯二醇-II轉(zhuǎn)化為了原人參二醇.這種能夠提高植物細胞色素P450單氧酶活性的通用方法也有望應用于酵母中的其他P450系統(tǒng).

2020年，Chen等[58]通過多個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行系統(tǒng)分析得到了189個AP2/ERF基因(PgERF001-189).APETALA2/乙烯反應因子(AP2/ERF)基因家族在植物生長發(fā)育、脅迫反應和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中起著至關重要的作用.對397個PgERF轉(zhuǎn)錄本分析表明，在不同組織、發(fā)育階段和基因型之間，其表達活性和網(wǎng)絡構造已基本呈現(xiàn)多樣化.隨機選擇DREB亞科中的6個PgERF基因進行冷脅迫處理實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PgERF基因的表達發(fā)生了顯著的變化.這表明DREB亞家族基因在植物對冷脅迫產(chǎn)生反應中起作用.進一步研究發(fā)現(xiàn)，PgERF基因?qū)岳蛩峒柞?MeJA)處理也會產(chǎn)生反應：397個PgERF基因轉(zhuǎn)錄物中有288個(72.5%)對MeJA處理有反應，其中上調(diào)的有136個，而下調(diào)的有152個.

此外，研究指出：作為PgGST、PgApx1和PgSOD這3個基因的上游轉(zhuǎn)錄因子，人參中屬于WRKY家族的PgWRKY6基因可能是通過體細胞胚發(fā)生中生長素與ROS的信號交聯(lián)作用，而在胚性愈傷組織的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[59]；人參的STS基因參與萜類化合物的生物合成，MeJA和SA的處理能夠使該基因表達上調(diào)，從而使人參產(chǎn)生更多的萜烯以抵御病原體(丁香假單胞桿菌番茄致病變種(PST))的侵襲[60]；人參尿苷依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶(PgUGT)72AL1參與了人參皂苷化合物K的生物合成，該基因的過表達會導致腋窩葉中的器官融合.JA、SA和ABA處理會使PgUGT72AL1表達下調(diào)[61]；人參液泡膜水通道蛋白編碼基因TIP1的過表達賦予了擬南芥更快的生長以及更高的鹽脅迫耐受性，這可能是因為PgTIP1的過表達影響了脅迫相關基因的表達.而且PgTIP1的蛋白質(zhì)生物學活性與第128位的絲氨酸(Ser)殘基有關.進一步研究發(fā)現(xiàn)，PgTIP1轉(zhuǎn)基因大豆品系除了表現(xiàn)出優(yōu)異的鹽脅迫耐受性外，也具有更強的根系活力，根和葉中細胞的細胞膜損傷減少，抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性增強，蒸騰速率(Tr)、光合速率(Pn)、葉片相對含水量(RWC)值增加.此外，該基因還能調(diào)整根、莖和葉中Na+、 K+和Cl-的分布方式.對應激相關基因的轉(zhuǎn)錄模式分析發(fā)現(xiàn)，鹽處理后的根和葉中一些與脅迫相關的基因(GmPOD、GmAPX1、GmSOS1和GmCLC1)的表達上調(diào)了.以上結(jié)果表明，PgTIP1基因表達導致耐鹽性提高的原因與植株中的水分關系、離子穩(wěn)態(tài)和ROS清除的正調(diào)控有關[62-63].

4.3 靈芝

近幾年，靈芝中含有β-1，3-葡聚糖和1，6-葡聚糖的多糖組分正受到越來越多的關注，因為它們具有抗氧化、抗癌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等重要的生物活性.在靈芝多糖的生物合成途徑中，磷酸葡糖突變酶(PGM)是核苷酸糖前體生物合成途徑中的關鍵酶，它負責糖分解代謝和糖合成代謝之間的聯(lián)系，催化6-磷酸葡萄糖和1-磷酸葡萄糖之間的相互轉(zhuǎn)化.Xu等[64]通過過表達磷酸葡糖突變酶(PGM)基因來提升靈芝多糖的產(chǎn)量，研究發(fā)現(xiàn)，PGM基因過表達會對細胞內(nèi)的多糖(IPS)含量、細胞外多糖(EPS)的產(chǎn)生有影響.還有就是會影響到3個基因的轉(zhuǎn)錄水平.而這3個基因編碼的都是與多糖生物合成相關的酶，它們分別是PGM、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)和β-1,3-葡聚糖合酶(GLS).過表達PGM基因靈芝的最大IPS和EPS含量分別比野生型菌株高出40.5%和44.3%.對工程菌株的研究表明，PGM、UGP和GLS的轉(zhuǎn)錄水平與野生型菌株相比分別上調(diào)了4.77、1.51和1.53倍，這表明較高的多糖生物合成可能就是由于這些基因的存在；除PGM基因外，Li等[65]將透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因?qū)腱`芝中使其異源表達，并通過觀察VHb特異性CO-差光譜證實了VHb的表達活性.對靈芝多糖生物合成相關基因的轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)，VHb基因也會影響PGM、UGP和GLS這3個基因的轉(zhuǎn)錄水平.與野生型相比，轉(zhuǎn)基因品系中的PGM、UGP和GLS的轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了1.51、1.55和3.83倍.而且轉(zhuǎn)基因品系靈芝中最高的IPS和EPS產(chǎn)量也增加了，分別比野生型菌株高30.5%和88.2%.以上研究表明，PGM基因和VHb基因都有著能夠提高靈芝多糖生產(chǎn)的潛力.

其他相關靈芝功能基因研究指出，靈芝中1,4-β-內(nèi)切葡聚糖酶的一個候選基因——GlCel5A表現(xiàn)出CMC(纖維素酶)水解活性.在畢赤酵母中表達的重組GlCel5A蛋白能夠水解CMC和β-葡聚糖，但不能水解木聚糖和甘露聚糖.該酶在60 ℃和pH 3～4時顯示最佳活性，并在80 ℃和90 ℃時仍能持續(xù)保持50%的活性至少15和10 min[66]；過氧化物酶超家族中的錳過氧化物酶基因GluMnP1可以在畢赤酵母中有效表達，并具有較高的氧化活性.除了能夠使4種類型的染料脫色外，HPLC驗證表明，該基因表達產(chǎn)物能夠降解苯酚.而苯酚的降解及氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生所依賴的主要途徑則是兒茶酚介導的循環(huán)途徑[67].此外，Xiang等[68]通過對靈芝基因組數(shù)據(jù)庫的廣泛搜索，確定了13個寡肽轉(zhuǎn)運蛋白 (Gl-OPT1-13).表達譜分析表明，除了未檢測到轉(zhuǎn)錄本的G1-OPT7-G1-OPT9外，所有旁系同源物均差異表達，暗示了它們可能參與了應激反應和人參的功能發(fā)育.

5 總結(jié)

從2011年至今，基于不同的測序平臺，通過一、二、三代測序技術的結(jié)合以及多種生物信息學分析方法，已經(jīng)有40多種藥用植物的全基因組序列被人們所洞悉.尤其是近幾年，已測序藥用植物基因組的數(shù)量快速增加，不僅說明生物技術的快速發(fā)展，也說明了藥用植物正越來越受到世界范圍性的關注.

本文主要對鐵皮石斛、人參、天麻、紅景天和靈芝這5種藥用植物的基因組測序進展做了詳細的描述，此外，還對鐵皮石斛、人參和靈芝的功能基因研究進展進行了簡要介紹.從已測序的藥用植物基因組報道來看，全基因組的解析使我們能夠從分子層面去了解藥物活性成分的產(chǎn)生過程、物種脅迫耐受性的由來、主要代謝途徑和道地藥材形成機制等等.從整體來看，藥用植物基因組中存在著大量的重復序列，而重復序列中又發(fā)現(xiàn)了眾多的轉(zhuǎn)座元件，這也就不難解釋藥用植物中的許多基因家族都存在著基因擴張現(xiàn)象.基因在基因組上的流動性促進了遺傳的多樣性，也為物種的進化提供了基礎.雖然不同藥用植物都有各自的特點，但從它們的基因組分析來看，與抗性、主要活性成分相關的基因家族普遍存在大量重復以及擴張現(xiàn)象，而對于那些有明顯特點的藥用植物而言，由于環(huán)境的改變以及自身的設定，它們的基因組相較于其祖先已經(jīng)有了很大的改變.比如：天麻通過實現(xiàn)特定基因收縮甚至缺失、擴張以及基因的新功能化以建立其特有的微生物共生模式，而這一過程中發(fā)生的基因缺失甚至包括了許多的保守基因；人參長期生長在地下，但卻仍然能夠進行高效的光合作用，這是因為人參中的CAB基因要比其他的植物多得多，此外，全基因組重復現(xiàn)象也使得人參具有更強的越冬能力從而能夠在嚴苛的環(huán)境中生存.由此可見，大多數(shù)藥用植物的基因組有著很大的可塑性，其上的基因會進行純化選擇以適應各種不同的環(huán)境.

對于功能基因而言，它們中大多數(shù)是以基因家族的形式存在的.因此，了解一個基因家族如何發(fā)揮作用是全面了解生物的必要條件.盡管隨著時空的變遷，基因家族的分化程度較高，具有多樣性，但是基因超家族的大多數(shù)成員表達時仍然互相關聯(lián)并形成共表達網(wǎng)絡.也就是說，相對于整個組織和發(fā)育階段，大多數(shù)同屬一個家族的基因具有一致的表達水平和模式.此外，由于藥用植物栽培過程中存在產(chǎn)量過低、品種退化、資源缺乏和生長條件不適等問題，目前對于功能基因的研究主要是集中于藥用活性成分、生長發(fā)育調(diào)控和抗脅迫耐受性等領域，以此來提高藥用植物的應用性和價值性.研究成果的內(nèi)容主要包括：1)于熱門宿主中異源表達目的基因以進一步研究其整體表達系統(tǒng)、表達量高低、表達產(chǎn)物純化等；2)通過過表達藥用植物中的特定基因從而提高產(chǎn)量或改變特定性狀；3)分析表達產(chǎn)物在不同器官中的含量以確認在最終收集時應該采集哪一部位最佳；4)向研究樣品中導入抗性基因以培育具有優(yōu)良商品性狀的品系.從個體來看，鐵皮石斛、靈芝、人參等較為有名的藥用植物的功能基因克隆發(fā)展迅速，分離鑒定到的功能基因數(shù)量快速增加，而如天麻、紅景天等物種的功能基因研究則仍然處于萌芽初期.整體來看，藥用植物的結(jié)構基因組學到功能基因組學的過渡比預期的要早，兩者相輔相成并相互滲透，難以劃出明確的分界線.但是，若要揭示基因組及其所包含的全部功能基因，并在此基礎上闡明遺傳、系統(tǒng)發(fā)育、進化、功能調(diào)控等基本生物學問題，以及解決人類健康和疾病相關的生物醫(yī)學問題，則是一項更加艱巨、耗時良久的工程.

目前藥用植物基因組研究所面臨的挑戰(zhàn)主要有：1)測序技術還有待進一步改善.一代測序技術存在通量低成本高的問題；二代測序技術引入的PCR過程在一定程度上會導致測序錯誤，更關鍵的是面對復雜基因組組裝時，讀長不足這一缺點會使其“束手無策”；而三代測序技術的測序錯誤率較高.因此，目前的測序往往會結(jié)合二、三代測序技術進行優(yōu)勢互補，如有必要再輔助以一代測序技術以保證基因組組裝的高質(zhì)量.2)基因組上大量基因功能尚未被注釋，精細功能基因組研究尚未完全展開.3)多數(shù)已知功能基因研究還處于基因分離階段，并且過度依賴于生物信息學預測，缺乏直接實驗證據(jù)(如基因功能驗證方法：RNA干擾技術、基因敲除技術和酵母雙雜交等).4)對于功能基因組仍處于單一對象的片面研究，還需要通過表達序列標簽(EST)、cDNA微陣列、基因表達連續(xù)分析法(SAGE)等進行大規(guī)模的基因功能分析，以及通過表觀遺傳和非編碼RNA調(diào)控分析來構建全面系統(tǒng)的分子信號網(wǎng)絡.綜上所述，人類對藥用植物基因組和功能基因的研究和認知依然十分有限，對其研究任重而道遠.