夏偉

常州市婦幼保健院病理科 （江蘇常州 213000）

全自動(dòng)病理組織脫水機(jī)以處理標(biāo)本量多、穩(wěn)定好及安全性高等優(yōu)點(diǎn)，一直以來得到了各醫(yī)院病理科和科研機(jī)構(gòu)的認(rèn)可[1]。一張優(yōu)質(zhì)的病理切片的產(chǎn)生需經(jīng)過諸多環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，病理組織脫水即為其中重要的環(huán)節(jié)[2]。組織塊在脫水機(jī)中的處理效果直接影響切片和染色質(zhì)量以及免疫組化、原位雜交、二代測序等檢測結(jié)果[1，3-4]。乙醇是病理實(shí)驗(yàn)室最常用的脫水劑，濃度過高或過低均會(huì)對(duì)組織處理產(chǎn)生不利影響，只有對(duì)乙醇濃度實(shí)施日常監(jiān)測，并采取相應(yīng)的措施，才可保證組織塊在每一個(gè)換液周期內(nèi)的脫水質(zhì)量，同時(shí)發(fā)揮試劑的最大效能，減少廢液排放，減輕維護(hù)保養(yǎng)人員的工作負(fù)擔(dān)[5]。基于此，本研究探討全自動(dòng)病理組織脫水機(jī)乙醇濃度的變化對(duì)組織塊的影響及應(yīng)對(duì)措施，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器設(shè)備：全自動(dòng)封閉式病理組織脫水機(jī)（櫻花精機(jī) 株 式 會(huì) 社，SAKURA Tissue-Tek-VP1型 ）；40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%、80%～90%、90%～100%的乙醇濃度計(jì)（精度為0.1%，河北省衡水創(chuàng)紀(jì)儀器儀表有限公司）；1 500 ml 量筒。

標(biāo)本：收集2019年3月至2020年3月常州市婦幼保健院的所有手術(shù)標(biāo)本、活檢及內(nèi)鏡標(biāo)本。

試劑：10%中性緩沖甲醛溶液（廣州維格斯生物科技有限公司）；分析純無水乙醇、二甲苯（江蘇永豐化學(xué)試劑有限公司）；高效切片石蠟（熔點(diǎn)為58～60 ℃，上海華靈康復(fù)器械廠）。

1.2 方法

工作原理：櫻花全自動(dòng)病理組織脫水機(jī)共16缸，第1～2缸為10%中性緩沖甲醛溶液，第3～8缸為不同濃度梯度的乙醇，依次從低濃度乙醇到純無水乙醇，第9～10缸為二甲苯，第11～14缸為液體石蠟，第15～16缸為清洗液，其中，第1～14缸容量均為3.50～3.75 L，第15～16缸容量均為5.00 L。

脫水處理時(shí)間及試劑更換如下。（1）脫水處理時(shí)間：第1缸10%中性緩沖甲醛溶液的處理時(shí)間為90 min，溫度設(shè)置為35 ℃；第2缸10%中性緩沖甲醛溶液的處理時(shí)間為120 min；第1、2、3～6缸乙醇的處理時(shí)間分別為90、70、60 min；兩缸二甲苯的處理時(shí)間分別為40 min 及35 min；四缸液體石蠟的處理時(shí)間分別為30、45、45及60 min；所有缸加壓/減壓（P/V）均打開。（2）試劑更換：將第1～2缸10%中性緩沖甲醛溶液倒掉，并更換新液體；將第1缸乙醇倒掉，清洗干凈并晾干，倒入無水乙醇放在第8缸，所有乙醇的缸前移一缸；將第9缸二甲苯倒掉，第10缸前移，并將第9缸更換新的二甲苯放在第10缸的位置；將第11缸的石蠟倒掉，依次前移后面3缸石蠟，第11缸倒入新的石蠟后放在第14缸的位置。

1.3 觀察指標(biāo)

所有乙醇試劑的濃度均在20 ℃條件下進(jìn)行檢測，先檢測每缸乙醇的基礎(chǔ)濃度，隨后每處理一批組織后，使用乙醇濃度計(jì)檢測每缸乙醇的濃度并記錄；分析所有組織塊HE染色切片的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 組織塊脫水效果

在脫水機(jī)運(yùn)行的第1～5次內(nèi)，所有組織塊均脫水良好；第6次偶有組織脫水不良，主要為淋巴結(jié)、乳腺組織，制片時(shí)易化開；第7次部分組織塊脫水不良，主要為宮內(nèi)膜及少量胎盤組織等，制片破碎，切完后的石蠟組織中央?yún)^(qū)內(nèi)陷，其余小組織塊均未見明顯異常。

2.2 一個(gè)換液周期內(nèi)乙醇濃度的變化

在一個(gè)換液周期內(nèi)，第1缸乙醇濃度降低最快，第2缸乙醇濃度降低次之，第3～6缸乙醇濃度變化量依次減小，見表1。

表1 換液前后乙醇濃度變化（%，±s）

表1 換液前后乙醇濃度變化（%，±s）

項(xiàng)目 換液后 換液前 變化量第 1 缸 78.5±1.8 52.3±3.2 31.9±2.1第 2 缸 90.7±0.9 81.3±2.3 12.2±1.6第 3 缸 95.5±0.6 92.0±1.0 4.9±0.9第 4 缸 97.8±0.4 96.3±0.6 2.6±1.2第 5 缸 99.3±0.3 98.3±0.4 1.7±0.5第 6 缸 99.9±0.1 99.6±0.3 0.7±0.3

2.3 一個(gè)換液周期內(nèi)組織塊總數(shù)及脫水次數(shù)

一個(gè)換液周期內(nèi)共處理（1 015±107）個(gè)組織塊，組織脫水機(jī)運(yùn)行（6±1）次。

2.4 組織塊HE 染色質(zhì)量

于顯微鏡下觀察HE 切片，細(xì)胞核著色清晰、核漿對(duì)比明顯、染色鮮艷，不影響病理診斷。

3 討論

階梯替換法與分組替換法是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的換液方法，旨在使乙醇保持一定的濃度梯度，置換組織內(nèi)的游離水，為透明、浸蠟提供條件，保證細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)不被破壞，便于切片及后續(xù)檢查等[6]。本研究通過對(duì)多個(gè)周期的乙醇濃度進(jìn)行檢測，得出乙醇濃度在一定范圍內(nèi)變化，可保證組織脫水質(zhì)量穩(wěn)定。

本研究通過檢測多個(gè)周期內(nèi)所有缸乙醇的濃度，發(fā)現(xiàn)第1、2缸乙醇的濃度變化幅度較大，聯(lián)合分析第1～2缸的乙醇濃度數(shù)據(jù)，有利于判斷脫水機(jī)的換液時(shí)機(jī)，監(jiān)測組織塊的脫水質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)?缸乙醇的濃度接近50%時(shí)，按照原來的脫水程序會(huì)出現(xiàn)部分大塊組織脫水不良的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[7]；當(dāng)?shù)?缸乙醇的濃度降低到50%附近時(shí)，第2缸乙醇的濃度接近80%，提示需對(duì)脫水機(jī)進(jìn)行乙醇更換；當(dāng)組織塊數(shù)≤150個(gè)時(shí)，通過縮短低濃度乙醇的脫水時(shí)間，適當(dāng)延長高濃度乙醇的脫水時(shí)間及二甲苯的透明時(shí)間，實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，組織脫水、透明、制片、染色均無顯著差異；當(dāng)組織塊數(shù)＜150個(gè)且均以小組織塊為主時(shí)，通過換液后處理發(fā)現(xiàn)，組織塊明顯質(zhì)地較硬、脆，制片困難，個(gè)別組織的脫水效果不佳。經(jīng)分析，其原因可能為濃度高的乙醇溶液脫水過快導(dǎo)致大組織塊表面硬化，影響乙醇的滲透、置換，導(dǎo)致組織塊內(nèi)水分未能完全置換出來，組織透明、浸蠟不良[7-9]。本研究還發(fā)現(xiàn)，大組織塊如宮內(nèi)膜、乳腺、胃腸等組織，在臨近換液時(shí)易發(fā)生脫水不徹底的現(xiàn)象，造成切片易化開，制片困難，切完片后組織蠟塊凹陷，原因可能為組織塊體積大、取材厚，當(dāng)乙醇濃度過低時(shí)，通過充分置換后的組織內(nèi)仍殘留較多的低濃度乙醇，經(jīng)過梯度乙醇脫水后，組織內(nèi)的水分未能充分置換，二甲苯與水不互溶，導(dǎo)致組織透明、浸蠟不能完成，組織蠟塊水分揮發(fā)最終出現(xiàn)蠟塊中心組織凹陷，因此，當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度降低到50%附近，且組織塊數(shù)量＞150個(gè)，含有較多的含水脂肪等大組織塊時(shí)，按照階梯替換法進(jìn)行換液后再作標(biāo)本處理，組織塊均處理良好，無明顯異常；當(dāng)嘗試通過縮短低濃度乙醇的脫水時(shí)間，適當(dāng)延長高濃度乙醇的脫水時(shí)間時(shí)，組織塊脫水不良。當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度≤80%時(shí)，換液后處理組織塊，組織塊脫水均未見明顯異常，因此，當(dāng)需更換試劑時(shí)，有必要參考最前面兩缸的乙醇濃度，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行換液。

現(xiàn)將以上情形總結(jié)如下：（1）當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度≤80%時(shí)，若組織塊數(shù)量≤150個(gè)，則選擇換液后處理或調(diào)整脫水程序后處理并且在下次脫水前換液；（2）當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＜80%時(shí)，若組織塊數(shù)量＞150個(gè)，則選擇換液后處理標(biāo)本；（3）當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＞80%時(shí)，若組織塊數(shù)量＜150個(gè)，則調(diào)整脫水程序后處理標(biāo)本并且在下次脫水實(shí)驗(yàn)前測量第2缸乙醇的濃度，若第2缸乙醇的濃度仍＞80%，且標(biāo)本量＜150個(gè)，則按（1）操作，若組織塊數(shù)量＞150個(gè)，則選擇換液后處理標(biāo)本；（4）當(dāng)?shù)?缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＞80%時(shí)，若組織標(biāo)本量＞150個(gè)，則選擇換液后處理標(biāo)本。

綜上所述，通過對(duì)乙醇濃度進(jìn)行日常檢測，發(fā)現(xiàn)了每缸乙醇濃度在每個(gè)換液周期內(nèi)的變化規(guī)律，并及時(shí)調(diào)整程序、更換新液，保證了每批組織塊的脫水質(zhì)量；通過對(duì)乙醇濃度尤其是前兩缸乙醇的濃度進(jìn)行定期檢測，有效把控了換液時(shí)機(jī)，保證了合理的乙醇濃度梯度。不同的實(shí)驗(yàn)室，其組織類型、數(shù)量不盡相同，脫水機(jī)種類、脫水程序也有所差異，建議各實(shí)驗(yàn)室在條件允許的情況下，通過參考本實(shí)驗(yàn)的方法選擇恰當(dāng)?shù)膿Q液方法及換液時(shí)機(jī)。