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提高溫度對(duì)靈芝抗氧化活性的影響

2021-01-15 08:18劉月芹高小朋賀曉龍
關(guān)鍵詞:靈芝自由基試劑盒

劉月芹,高小朋,賀曉龍

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安716000)

靈芝(Ganodermalucidum),是我國(guó)一類傳統(tǒng)藥用真菌的統(tǒng)稱,靈芝作為珍貴的中藥材,在我國(guó)作為延年益壽和滋補(bǔ)身體之用,已有2000多年的歷史,素有“仙草、瑞草”之美譽(yù)[1-3]。

諸多學(xué)者的研究證明,人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基及其反應(yīng)會(huì)加速衰老及誘導(dǎo)各種生活習(xí)慣病,引發(fā)諸多慢性疾病[4]。而抗氧化劑能有效清除活性氧自由基,減緩人體衰老,預(yù)防疾病。目前,攝入外源性抗氧化劑是緩解氧化壓力、預(yù)防多種疾病、提高機(jī)體的抗氧化能力的一種非常有效的措施,使得合成抗氧劑在醫(yī)療和食品領(lǐng)域越來越被大眾所接受[5]。但是由于合成抗氧化劑對(duì)人體存在潛在危害,使合成抗氧化劑在食品和藥物中的應(yīng)用受到一定的限制,所以研究開發(fā)安全無(wú)毒副作用的天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑必將成為食藥領(lǐng)域研究熱點(diǎn)[6,7]。藥用真菌不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還具有多種生理活性,是開發(fā)天然、高效、具有醫(yī)療保健功效的抗氧化食品或藥品的最佳選擇,具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景[8]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí),靈芝具有非常豐富的藥理活性,如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、通過增強(qiáng)宿主免疫調(diào)節(jié)達(dá)到抑腫瘤作用、促進(jìn)體內(nèi)生理代謝、通過提高氧化酶活性而清除體內(nèi)自由基達(dá)到抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心、降血糖血脂等[9]。靈芝的抗氧化能力主要體現(xiàn)在對(duì)羥自由基、超氧陰離子的清除能力上[10,11]??梢婌`芝是開發(fā)天然、高效、具有醫(yī)療保健功效的抗氧化食品或藥品的最佳選擇[12]。

近年來,液體發(fā)酵技術(shù)以其具有周期短、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于大型食藥用菌領(lǐng)域[13]。本論文參考了國(guó)內(nèi)外對(duì)藥用真菌液體發(fā)酵技術(shù)及其抗氧化活性方面的研究進(jìn)展,進(jìn)一步創(chuàng)新研究。因?yàn)殪`芝屬高溫型菌類,生長(zhǎng)溫度范圍較廣,故本實(shí)驗(yàn)采用逐漸提高培養(yǎng)溫度進(jìn)行液體發(fā)酵,以抗壞血酸含量、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性和過氧化氫酶活性為測(cè)定指標(biāo),對(duì)靈芝較高溫度液體發(fā)酵過程中的抗氧化活性進(jìn)行研究。探究提高溫度液體發(fā)酵中靈芝抗氧化活性的變化規(guī)律,以期對(duì)靈芝作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用有所助益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株

靈芝菌株(G.lucidumCGMCC 5.616)購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,保存于4℃冰箱PDA斜面培養(yǎng)基。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,去離子水1000 mL,pH 5.0。種子固體培養(yǎng)基:在種子液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂20 g。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖25 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5g,維生素B 0.02 g,去離子水1000 mL,pH 5.0。

1.1.3 試劑

葡萄糖、無(wú)水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂粉、AsA測(cè)定試劑盒、T-AOC測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、POD測(cè)定試劑盒和CAT測(cè)定試劑盒都購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司,VS-1300U);紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá),UV-1200);組合式光照振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚,ZQZY-BG);超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司,DW-86L388);恒溫干燥箱(上海一恒,BPG-9156A);恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒,DHP-9902);恒溫水浴鍋(上海一恒,HWS-26);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德,5424)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方案

采用靜置與振蕩相結(jié)合的分段培養(yǎng)方案。種子液的制備:保存于4℃斜面培養(yǎng)基上的靈芝菌株經(jīng)活化后,重新保存于PDA平板培養(yǎng)皿中。然后用滅過菌的直徑為1 cm的打孔器,對(duì)保存于培養(yǎng)皿中的靈芝母種進(jìn)行取樣,取靈芝母種4塊接種于盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶(250 mL)中。26℃,150 r/min,避光振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵培養(yǎng):將上述得到的種子液按10%(v/v)的接種量接種于盛有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中。先置于26℃下高速200 r/min先振蕩培養(yǎng)1 d,然后將培養(yǎng)溫度提高2℃達(dá)28℃培養(yǎng)至第3 d,此后每隔2 d將培養(yǎng)溫度提高2℃,靜置培養(yǎng)至第9 d,溫度最后達(dá)到34℃。發(fā)酵培養(yǎng)期間,每隔2 d,每個(gè)溫度下取樣3瓶,培養(yǎng)液經(jīng)12000 r/min離心10 min,取上清液,測(cè)定T-AOC、SOD、POD和CAT活性。留下的菌絲體經(jīng)干燥后用于AsA含量的測(cè)定。

1.2.2 AsA含量測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所AsA測(cè)定試劑盒。取干燥后的菌絲體0.1g,加試劑盒中的指定試劑研磨,離心取上清液。然后按照說明書將樣品與各試劑旋渦混勻,37℃孵育30 min,后于波長(zhǎng)536 nm,1 cm光徑,比色,測(cè)定各管吸光度值,最后根據(jù)公式換算成抗壞血酸的含量。

1.2.3 SOD酶活測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所T-SOD測(cè)定試劑盒進(jìn)行,按照說明書將各試劑混勻,室溫放置10 min,后于波長(zhǎng)550 nm,1 cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,比色。定義:37℃每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)活力單位(U)。

1.2.4 CAT酶活測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所CAT測(cè)定試劑盒。按照說明書將各試劑混勻,常溫放置10 min,后于波長(zhǎng)405 nm,雙蒸水調(diào)零,測(cè)定各管吸光度值。定義:37℃下,1 min內(nèi)1.0 mL樣品,能使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01所需的樣品量為1個(gè)CAT單位(U)。

1.2.5 POD酶活測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所POD測(cè)定試劑盒。按照說明書將各試劑混勻,常溫放置10 min,后于波長(zhǎng)420 nm,雙蒸水調(diào)零,測(cè)定各管吸光度值。定義:37℃下,1 min內(nèi)1.0 mL樣品,能使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01所需的樣品量為1個(gè)POD單位(U)。

1.2.6 T-AOC測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所T-AOC測(cè)定試劑盒。按照說明書將各試劑混勻,常溫放置10 min,后于波長(zhǎng)520 nm,雙蒸水調(diào)零,測(cè)定各管吸光度值。定義:37℃下,1 min內(nèi)1.0 mL樣品,能使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01所需的樣品量,為1個(gè)總抗氧化能力單位(U)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均用mean±SD表示。利用SPSS 15.0進(jìn)行方差分析,多重比較不同溫度下的顯著性差異。P<0.05為有顯著性差異;P<0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度培養(yǎng)階段下的AsA含量

抗壞血酸(AscorbicAcid,AsA)又名維生素C,是一種自由基清除劑,可以很快地清除O-2,因此,抗壞血酸可以保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)源性氧自由基的損傷。本研究對(duì)不同溫度發(fā)酵階段下的AsA含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如下圖1所示,研究發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),AsA含量整體上呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),并在發(fā)酵的第7 d,發(fā)酵溫度達(dá)到32℃時(shí),AsA含量達(dá)到最大值為2.66±0.04 mg/100 g,比26℃和28℃下的AsA含量分別提高了1.11倍(P=0.01376)和42.25%(P=0.04163),差異顯著。30℃和34℃溫度下,AsA含量在發(fā)酵的第5 d和第9 d分別達(dá)到2.45±0.08和2.32±0.06 mg/100 g,其值都低于32℃下的AsA含量,但分別比26℃下的AsA含量提高了94.44%和84.12%,顯著性差異(P<0.05)。26℃和28℃下的AsA含量以及30℃、32℃和34℃下的AsA含量無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的逐步升高,AsA含量有顯著的上升,但過高的溫度(34℃以上)會(huì)導(dǎo)致靈芝細(xì)胞活力下降,消除活性氧自由基的能力也下降。

2.2 不同溫度培養(yǎng)階段下的SOD酶活

SOD是生物抗氧化酶類中的重點(diǎn)酶,是清除各種氧化物質(zhì)的重要因素。SOD的作用機(jī)制為催化超氧化物的歧化反應(yīng),然后將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2,最后H2O2再被過氧化氫酶和其他氧化物酶轉(zhuǎn)化為水分子,這樣就達(dá)到了清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基、維持機(jī)體代謝平衡的重要目的[14]。不同溫度培養(yǎng)階段下的SOD酶活變化如圖2所示:培養(yǎng)前3 d,SOD酶活變化不大,但第3 d后,SOD酶活呈現(xiàn)直線上升趨勢(shì)。第7 d后,SOD酶活趨于平穩(wěn),在發(fā)酵的第9 d達(dá)到最高為47.02±1.26 U/mL,比26℃、28℃下的SOD酶活分別提高了75.84%和73.28%,差異顯著(P<0.05)。30℃、32℃溫度下的SOD酶活都低于34℃,但都比26℃、28℃下的SOD酶活有明顯提高,且差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和培養(yǎng)溫度的逐步提高,靈芝菌絲的生長(zhǎng)性能受到影響,從而導(dǎo)致酶活的下降,但較高的培養(yǎng)溫度確實(shí)提高了靈芝細(xì)胞內(nèi)SOD的酶活,從而抵抗高溫帶來的氧化脅迫。

2.3 不同溫度培養(yǎng)階段下的CAT酶活

過氧化氫酶(CAT)也是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,能催化過氧化氫分解成氧和水,能有效地清除細(xì)胞體內(nèi)的活性氧自由基。通過逐步提高靈芝液體發(fā)酵溫度,發(fā)現(xiàn)CAT酶活隨著發(fā)酵溫度的提高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),如圖3所示:在發(fā)酵的前5 d,CAT酶活有所升高,但上升幅度不大。從第5 d開始,CAT酶活有個(gè)快速的上升趨勢(shì),在發(fā)酵的第7 d,發(fā)酵溫度為32℃時(shí),CAT酶活達(dá)到最大值為50.68±1.52 U/mL,比26℃﹑28℃和30℃下的CAT酶活分別提高了57.24%﹑47.93%和43.37%,差異顯著(P<0.05)。在發(fā)酵的第9 d,發(fā)酵溫度為34℃時(shí),CAT酶活有所降低,但下降幅度不大,為46.97±1.03 U/mL。26℃﹑28℃和30℃下的CAT酶活以及32℃和34℃下的CAT酶活都無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明,30℃~32℃溫度范圍內(nèi),有利于CAT酶活的提高,一定程度上提高了清除細(xì)胞體內(nèi)活性氧的能力。

2.4 不同溫度培養(yǎng)階段下的POD酶活

過氧化物酶是由微生物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶,主要功能是減輕過氧化氫對(duì)機(jī)體的傷害,其活性應(yīng)激性變化被作為反映微生物受逆境脅迫的一個(gè)重要指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同溫度培養(yǎng)階段下的POD酶活,整體上呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),如圖4所示,這一趨勢(shì)和AsA含量變化一致。在發(fā)酵的第7 d和第9 d,POD酶活分別為1.87±0.04和1.68±0.05 U/mL,是26℃溫度下的1.46倍和1.19倍,具有極其顯著性差異(P<0.01),比28℃﹑30℃下的POD酶活提高了40%以上,差異顯著(P<0.05)。此外,30℃下的POD酶活也比26℃下的提高了59.12%,差異顯著。結(jié)果表明,適當(dāng)?shù)奶岣吲囵B(yǎng)溫度,尤其是30℃~32℃溫度范圍內(nèi),能有效激活并提高了靈芝細(xì)胞內(nèi)POD酶活,更好地抵抗高溫帶來的氧化脅迫。

2.5 不同溫度培養(yǎng)階段下的總抗氧化能力比較

抗氧化能力是指物質(zhì)對(duì)機(jī)體內(nèi)各種氧化物質(zhì)的清除能力[15]。逐漸提高液體培養(yǎng)溫度,9 d內(nèi)靈芝的總抗氧化能力變化如圖5所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的不斷提高,T-AOC呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),在發(fā)酵的第5 d(30℃)、第7 d(32℃)和第9 d(34℃),T-AOC值分別為65.12±2.65、87.16±4.27和73.29±3.11 U/mL,雖然3個(gè)溫度下的T-AOC值無(wú)顯著性差異,但卻是26℃和28℃下的2倍多,有極其顯著性差異(P<0.01)。28℃下的T-AOC值高于26℃下的,但2個(gè)溫度下的T-AOC值并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明,隨著溫度的提高,靈芝總抗氧化能力有一定的提高,靈芝細(xì)胞體內(nèi)清除各種氧化物質(zhì)的能力加強(qiáng),以適應(yīng)高溫的刺激。

3 討論

溫度是影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素,高溫培養(yǎng)條件下,微生物細(xì)胞體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基,嚴(yán)重影響細(xì)胞的活力。為抵抗高溫脅迫,微生物細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)以消除自由基[16]。研究表明靈芝是藥用真菌,具有很強(qiáng)的抗氧化作用[17,18]。雖然也有通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高了靈芝的抗氧化性,但高溫條件下對(duì)靈芝抗氧化性能影響的考察很少[12]。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)采用液體發(fā)酵技術(shù),逐級(jí)提高發(fā)酵溫度,來探究高溫對(duì)靈芝液體發(fā)酵過程中抗氧化活性的影響,為靈芝作為天然安全高效的抗氧化劑來進(jìn)一步開發(fā)利用的可行性進(jìn)行探究與評(píng)價(jià)。

通過本文的研究發(fā)現(xiàn),除了SOD酶活隨著培養(yǎng)溫度的升高而上升外,靈芝發(fā)酵液中的AsA含量、CAT、POD和T-AOC活性整體上呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì),且都在發(fā)酵溫度為32℃,發(fā)酵時(shí)間為第7 d時(shí)達(dá)到最大值,比26℃溫度下的AsA含量、CAT、POD和T-AOC活性分別提高了1.11倍﹑57.24%﹑1.46倍和4.19倍。微生物細(xì)胞內(nèi)的酶系一般需要在較高的溫度下才能發(fā)揮到最佳酶活,這一溫度多半情況下是高于微生物的最適生長(zhǎng)溫度的。有研究表明隨著培養(yǎng)溫度的升高,靈芝的漆酶和纖維素酶的酶活也不斷提高,較高的溫度有利于酶的分泌[19-21]。我們的結(jié)果表明在整個(gè)發(fā)酵期間,較高的發(fā)酵溫度提高了靈芝抗氧化酶的酶活。雖然高溫引起靈芝細(xì)胞內(nèi)高濃度的活性氧自由基,但是高溫同時(shí)也激活并提高了抗氧化酶系的活性,有效地抵抗了高溫脅迫。

研究證實(shí),在液體培養(yǎng)條件下,溫度對(duì)靈芝抗氧化系統(tǒng)有顯著的影響,較高的溫度提高了靈芝抗氧化能力。這為靈芝作為天然抗氧化劑開發(fā)利用提供了新的思路和方法,有較好的理論依據(jù)和參考價(jià)值。

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