單媛媛，劉婷婷，馬瑛，王茂義

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院藥學部，陜西 西安 710061)

查爾酮是一種重要的活性天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)為1,3-二苯基-2-丙烯基-1-酮，廣泛存在于甘草、紅花等藥用植物[1]，具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性[2]，其抗腫瘤活性主要是對受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)的抑制[3]。RTK在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，其中，表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2)、成纖維細胞生長因子受體-1(FGFR1)3種RTKs的表達異常與多種腫瘤密切相關(guān)，已成為抗腫瘤藥物研究的有效靶標[4]。尤為重要的是，這3種RTKs具有高度保守的一級序列和三維結(jié)構(gòu)，其配體結(jié)合位點和酪氨酸激酶催化區(qū)域高度相似，使得設(shè)計同時針對這3種RTKs的多靶標抑制劑成為可能，也有利于解決單靶標抑制劑的耐藥性的缺陷[5]。

基于查爾酮為先導(dǎo)化合物，設(shè)計并合成新型查爾酮衍生物類多靶標RTKs抑制劑，通過體外活性篩選有望發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的新型查爾酮衍生物[6]。基于已報道對RTKs有抑制活性且結(jié)構(gòu)對稱的聯(lián)苯化合物為先導(dǎo)物，首先采用分子剖裂原理將對稱的聯(lián)苯化合物破裂為兩分子苯氧基乙酰苯胺結(jié)構(gòu)[7]，分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：苯氧基乙酰苯胺結(jié)構(gòu)與查爾酮的結(jié)構(gòu)母核類似，而且其結(jié)構(gòu)中不存在α，β-不飽和羰基共軛結(jié)構(gòu)片段，因此不會與體內(nèi)谷胱甘肽的硫醇發(fā)生親電反應(yīng)[8]，被谷胱甘肽還原，所以保留了查爾酮本身的藥效結(jié)構(gòu)特征與生物活性[9]。在此基礎(chǔ)上，引入含有氫鍵供受體網(wǎng)絡(luò)的苯甲酰胺、溴代苯甲酰胺結(jié)構(gòu)作為RTKs抑制劑的鉸鏈區(qū)結(jié)合基團[10]，并重點考察末端苯胺上不同取代基對活性的影響[11]，設(shè)計了查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮-BAA)(見圖1)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 化合物合成所需的試劑按照標準操作流程處理，常用有機溶劑主要購自天津科密歐試劑公司、青島海洋化工有限公司、國藥集團試劑公司等。所用試劑除了有特殊說明之外均為分析純，合成操作中除水相反應(yīng)外，其他實驗操作按照標準操作程序除水，無氧反應(yīng)操作均在氮氣等惰性氣體保護下進行?；衔锖铣芍兴蟹磻?yīng)通過薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程。目標化合物及關(guān)鍵中間體的熔點采用予華儀器有限責任公司的X-4型數(shù)顯熔點測定儀測定(溫度未經(jīng)校正)。目標化合物的1H-NMR(400 MHz)由西安交通大學理學院核磁共振儀(Bruker Advance AC 400)測定，測試所用氘代溶劑為DMSO-d6和CDCl3，采用四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，化學位移值δ單位為ppm。目標化合物的EI-MS由西安交通大學藥學院HPLC-MS-QP2010測定。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 化合物的制備[12]基于以上結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，完成了共35個查爾酮衍生物(查爾酮BAA1～35)的合成(合成路線1與合成路線2)。該系列化合物以異香草醛(1)為起始原料，首先以NaOH/KOH為氧化劑將異香草醛氧化為異香草酸(2)，然后將其羥基以芐基保護得到中間體(3)，再與氯化亞砜反應(yīng)生成酰氯，將得到的酰氯分別與甲胺、異丙胺、二乙胺反應(yīng)得到相應(yīng)的苯甲酰胺關(guān)鍵中間體(4)。此外，將各種取代苯胺與氯乙酰氯反應(yīng)得到相應(yīng)的氯乙酰苯胺(6)。最后將前面制備的苯甲酰胺關(guān)鍵中間體(5)與取代氯乙酰苯胺(6)反應(yīng)制得相應(yīng)的查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮BAA1～21)，見圖2。

化合物2的合成：稱取1.0 g氫氧化鈉，1.5 g氫氧化鉀加入三頸瓶中，加入0.3 mL蒸餾水，混合物加熱至160 ℃使其熔融。分5批緩慢加入3.0 g異香草醛，熔融狀態(tài)下繼續(xù)反應(yīng)10 min，停止加熱待反應(yīng)混合物溫度降至室溫后，加水100 mL使混合物全部溶解，冰浴條件下用2 mol·L-1鹽酸將混合物調(diào)pH至1～2?；旌衔锶芤褐苯映闉V，用水洗滌濾餅2～3次既得產(chǎn)物，將產(chǎn)物放入真空干燥箱干燥。

化合物3的合成：化合物2(3.47 g,15 mmol)溶于70 mL無水乙醇中，加入無水碳酸鉀(6.22 g,45 mmol)和氯化芐(2.30 mL,20 mmol)，回流反應(yīng)6 h，除去碳酸鉀，減壓蒸除乙醇，乙酸乙酯(30 mL×3)提取，分別用H2O (3×30 mL),2 mol·L-1NaOH 水溶液(3×30 mL),2 mol·L-1HCl 水溶液(3×30 mL)，飽和氯化鈉水溶液 (2×30 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物(4.56 g,95%) 。

化合物4的合成：將化合物3(6.72 g,26 mmol)溶于10 mL無水二氯甲烷中，冰浴條件下緩慢滴加5.82 mL氯化亞砜的二氯甲烷溶液和5滴催化量的二甲基甲酰胺(DMF)，室溫條件下3 h。待反應(yīng)完全后減壓蒸除溶劑，將產(chǎn)物溶于無水二氯甲烷中備用。冰浴條件下，將上述酰氯的無水二氯甲烷溶液(25 mL)緩慢逐滴加入22.91 mL 30%的甲胺水溶液中，冰浴反應(yīng)2 h后升溫至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，加入10 mL水，分液，水相用二氯甲烷(3×30 mL)提取，合并有機相，有機相分別用2 mol·L-1的鹽酸(3×25 mL)，水(2×25 mL)，飽和碳酸氫鈉(2×25 mL)，飽和氯化鈉(2×20 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分析得到產(chǎn)物(3.16 g,84%)。

化合物5的合成：化合物4(3.49 g,10 mmol)溶于100 mL無水甲醇中，加入10%的Pd/C(0.10 g)。通入氫氣還原反應(yīng)，室溫條件下攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完全后，過濾，回收Pd/C,減壓蒸除甲醇，得到產(chǎn)物(2.58 g,97%)。

目標化合物(BAA1)的合成：將化合物5(1.58 g,5.90 mmol)溶于70 mL無水乙醇中，加入無水碳酸鉀(2.45 g,17.70 mmol)。反應(yīng)混合物室溫條件下攪拌反應(yīng)30 min，加入化合物6 (1.54 g,6.49 mmol)?；旌衔锘亓鞣磻?yīng)10 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，待反應(yīng)完全后，過濾除去碳酸鉀，減壓蒸除乙醇，乙酸乙酯(3×20 mL)提取，有機相依次用H2O (3×10 mL)、2 mol·L-1NaOH(3×10 mL)、2 mol·L-1HCl (3 ×10 mL) 和飽和氯化鈉水溶液 (2×10 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥。柱層析分離得到目標化合物BAA1(2.13 g,78%)。mp:197～198 ℃。EI-MS(m/z):366.1 (M+)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.88 (s,1H),7.80 (d,J=4.7 Hz,1H),7.51(s,1H),7.46(d,J=8.4 Hz,2H),7.17-7.12 (m,1H),6.97 (d,J=8.4 Hz,1H),6.27 (s,1H),4.69 (s,2H),4.00(s,3H)。3.03 (s,3H)?；衔顱AA2～21的制備方法與BAA1相同。

查爾酮衍生物(查爾酮BAA22～35)的合成見合成路線2，該系列化合物同樣以異香草醛為起始原料，首先以液溴為溴化試劑制備溴代異香草醛，將其羥基以芐基保護，然后以次氯酸鈉為氧化劑將醛基氧化為羧基制備溴代異香草酸。再與氯化亞砜反應(yīng)生成酰氯，將得到的酰氯分別與甲胺、異丙胺、二乙胺反應(yīng)得到相應(yīng)的苯甲酰胺關(guān)鍵中間體。此外，將各種取代苯胺與氯乙酰氯反應(yīng)得到相應(yīng)的氯乙酰苯胺。最后將前面制備的苯甲酰胺關(guān)鍵中間體與取代氯乙酰苯胺反應(yīng)制得相應(yīng)的查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮BAA22～35)(見圖3)。

1.2.2 體外抗腫瘤活性篩選[13-14]體外篩選了目標化合物對EGFR(表皮生長因子受體)、VEGFR-2(血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2)和FGFR1(成纖維細胞生長因子受體-1)3種受體酪氨酸激酶的抑制活性；細胞水平篩選了目標化合物對乳腺癌細胞(MCF-7)、非小細胞肺癌細胞(A549)、白血病細胞(K562)3種腫瘤細胞的增殖抑制活性[14]；尋找基于EGFR/VEGFR-2/FGFR1多靶標的抗腫瘤候選化合物。目標化合物對受體酪氨酸激酶抑制活性篩選所用的試劑盒為ADP-Glo Kinase Assay檢測試劑盒(Promega)，實驗對照藥物選用吉非替尼(Gefitinib)；腫瘤細胞增殖抑制活性篩選采用經(jīng)典的噻唑藍(MTT)方法，對照藥物選用吉非替尼(Gefitinib)。

查爾酮衍生物對EGFR、VEGFR-2和FGFR1 3種RTI抑制活性結(jié)果(見表1)可以看出，與陽性藥吉非替尼相比，大部分化合物對EGFR、VEGFR-2和FGFR1具有一定程度的抑制活性。對EGFR抑制活性中，化合物BAA22、BAA23、BAA30和BAA31的活性結(jié)果接近(IC50小于20 nmol·L-1)吉非替尼(IC50=4.07 nmol·L-1)，這4個化合物的結(jié)構(gòu)特征是結(jié)構(gòu)母核為溴代苯甲酰胺結(jié)構(gòu)，末端苯胺為3-氯-4-氟苯胺或者3-三氟甲基苯胺；化合物BAA25對EGFR無抑制活性，說明溴代苯甲酰胺是EGFR的有效結(jié)構(gòu)片段，而3-氯-4-氟苯胺或者3-三氟甲基苯胺對EGFR的抑制活性是必需的；有11個化合物的IC50值在1～30 nmol·L-1，其中有4個化合物的活性在20 nmol·L-1以下，值得深入研究。對于VEGFR-2，4個化合物的活性結(jié)果較好，分別是BAA10(IC50=17.09 nmol·L-1)，BAA16(IC50=14.65 nmol·L-1)，BAA19(IC50=15.50 nmol·L-1)和BAA30(IC50=12.44 nmol·L-1)；對于FGFR1，目標化合物的抑制活性普遍低于對EGFR和VEGFR-2的抑制活性，說明該系列化合物對FGFR1的選擇性不如EGFR和VEGFR-2，其次，化合物BAA1(IC50=19.54 nmol·L-1)，BAA3(IC50=13.69 nmol·L-1)和BAA29(IC50=19.23 nmol·L-1)的活性較好。從整體活性結(jié)果顯示，化合物BAA30對EGFR、VEGFR-2和FGFR1的抑制活性均較好，特別是對EGFR和VEGFR-2的抑制活性明顯高于其他化合物，說明BAA30結(jié)構(gòu)中的溴代苯甲酰胺是較為理想的多靶標酪氨酸激酶抑制劑鉸鏈區(qū)結(jié)合基團，其末端的3-三氟甲基取代基對于保持化合物的多靶標抑制活性是必需的。

表1 查爾酮衍生物對受體酪氨酸激酶的抑制活性結(jié)果(IC50,nmol·L-1)

表1(續(xù))

查爾酮衍生物對乳腺癌細胞(MCF-7)、非小細胞肺癌細胞(A549)、白血病細胞(K562)的增殖抑制活性見表2。大部分衍生物對3種腫瘤細胞均具有一定的增殖抑制活性，其中活性最高的化合物是BAA23，其結(jié)構(gòu)特征為苯甲酰胺母核上2-位為溴取代基，末端苯胺為3-三氟甲基苯胺，對MCF-7、A549、K562的抑制活性IC50值分別為5.42、8.27、9.82 μmol·L-1。對于不含溴的苯甲酰甲胺類衍生物，活性最高的是BAA5(末端為4-溴苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為12.7、15.2、13.3 μmol·L-1。對于不含溴的苯甲酰異丙胺類衍生物，活性最高的是BAA8(末端為3-三氟甲基苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為21.7、10.4、8.93 μmol·L-1；該系列中對MCF-7抑制活性最高的是BAA14(末端為3-氟苯胺)。對于不含溴的苯甲酰二乙胺類衍生物，活性最高的是BAA16(末端為3-三氟甲基苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為24.1、20.4、12.4 μmol·L-1。對于苯甲酰胺母核上含溴取代基的化合物(BAA22～BAA35)，其抗腫瘤活性普遍優(yōu)于不含溴的衍生物，包括活性最高的化合物BAA23。苯甲酰甲胺類衍生物中BAA26和BAA27對3株腫瘤細胞的增殖抑制活性值在20～30 μmol·L-1之間，活性較好。苯甲酰異丙胺系列化合物中，BAA33和BAA36的活性較好，與BAA26接近?？偨Y(jié)苯甲酰胺系列衍生物構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)：苯甲酰胺母核上溴取代基有利于提高活性，末端苯胺上的三氟甲基與氟取代基有利于抗腫瘤活性。

表2 查爾酮衍生物對不同腫瘤細胞株的抗增殖活性(IC50,μmol·L-1)

表2(續(xù))

2 討論

以查爾酮為先導(dǎo)化合物，針對查爾酮母核結(jié)構(gòu)中α,β-不飽和雙鍵的缺陷，共設(shè)計、合成了35個新型查爾酮衍生物。合成路線合理，反應(yīng)條件比較溫和，均由廉價易得的異香草醛為原料制備。體外活性實驗表明，大部分化合物具有較好的RTK抑制與抗腫瘤活性，部分化合物的活性接近陽性對照的水平。為新型查爾酮先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了依據(jù)。