梁希晨，劉雪楓，王灝，景明

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省禮縣第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 隴南 742200)

1 儀器與材料

E2695高效液相色譜儀(沃特世科技上海有限公司，色譜柱為WondaSil C18-WR色譜柱)；BT125D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；iMark全波長酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)。

濕生扁蕾藥材于2018年7月上旬采自甘肅省臨潭縣冶力關(guān)鎮(zhèn)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定為濕生扁蕾[Gentianopsispaludosa(Munro.) Ma]。當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素(成都普菲德生物技術(shù)有限公司， 批號分別為190402、190404、190328，純度均> 98%)；甲醇、磷酸為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，批號：MKBS3069V)；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，北京百靈威試劑有限公司，批號：1436401)；抗壞血酸(Vc， 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，批號：MSDS5960)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備 稱取藥材濕生扁蕾500 g，粉碎，分別用5倍量的水、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯浸泡22 h后回流提取2 h。提取液回收溶劑后減壓干燥得到干燥提取物，研細(xì)備用。水提物(A)、95%乙醇提取物(B)、正丁醇提取物(C)和乙酸乙酯提取物(D)產(chǎn)率分別為16.92%、15.56%、5.57%、11.66%。

2.2 HPLC同時測定當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素的含量[6]

2.2.1 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.04%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～20 min,40%～63% A；20～50 min,63%A)；體積流量0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素對照品1.5、1.8、0.5 mg，置于5 mL容量瓶中，以甲醇溶液超聲使完全溶解，制成當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素質(zhì)量濃度分別為0.30、0.36、0.10 mg·mL-1的混合對照品溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取水提物粉末0.049 4 g、95%乙醇提取物粉末0.050 7 g、正丁醇提取物粉末0.051 0 g、乙酸乙酯提取物粉末0.051 0 g，置5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液，密塞，超聲溶解，以甲醇溶液定容，以0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，0.5、1、2、5、10、15、20 μL依次注入高效相色譜儀，依“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1?？芍?，3種成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，以“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下測定，重復(fù)測定5次，得當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素峰面積的RSD分別為1.29%、1.18%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察 按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備5份95%乙醇提取物供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素面積的RSD分別為1.19%、1.54%、1.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取95%乙醇提取物供試品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、3、6、12、18、24 h測定，測得當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素峰面積的RSD分別為2.91%、2.71%、2.32%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率考察 精密吸取已測定指標(biāo)成分含量的95%乙醇提取物供試品溶液1 mL，共6份，分別置于10 mL量瓶中，每份精密加入含有一定量的當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的混合對照品溶液各1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的平均加樣回收率分別為99.37%、99.93%、100.69%，RSD分別為0.97%、1.22%、1.12%，回收率均符合規(guī)定，表明該方法回收率良好。

2.2.9 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液10 μL， 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定記錄色譜圖，測定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸。濕生扁蕾不同提取物樣品中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素的含量測定結(jié)果見表2。乙酸乙酯提取物中當(dāng)藥黃素含量最高，為68.19 mg·g-1；95%乙醇提取物中當(dāng)藥醇苷含量最高，為21.03 mg·g-1；正丁醇提取物中木犀草素含量最高，為19.38 mg·g-1。

表2 濕生扁蕾各提取物主要成分含量測定結(jié)果(mg·g-1)

2.3 清除DPPH·能力測定[7]

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取濕生扁蕾不同提取物供試品和陽性對照Vc各0.01 g，用無水乙醇溶解(水提物用50%乙醇溶解)并定容至10 mL，得到濃度為1 mg·mL-1的溶液。用無水乙醇稀釋成濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mg·mL-1的供試品溶液。

2.3.2 DPPH溶液的制備 精密稱取DPPH 0.019 7 g，加12.5 mL無水乙醇溶于15 mL離心管(離心管外壁用黑布包裹)，搖勻得到濃度為1.576 mg·mL-1的DPPH母液。精密吸取1 mL DPPH母液，加39 mL無水乙醇，得濃度為0.039 4 mg·mL-1的DPPH溶液，置于4 ℃冰箱中，避光冷藏。

2.3.3 測定方法及結(jié)果 無水乙醇、DPPH溶液各250 μL，記為A0管；供試品溶液、DPPH溶液各250 μL，記為A1管；無水乙醇、供試品溶液各250 μL，記為A2管；以上各管充分振搖混勻，置暗處反應(yīng)30 min后，取200 μL加到96孔板中，于517 nm處測定吸光度。平行測定3次。按公式1計(jì)算各供試品DPPH·清除率和IC50值。

(公式1)

表3結(jié)果表明，濕生扁蕾各提取物對DPPH·均有顯著的清除作用，但均弱于陽性對照Vc組。IC50越小說明供試品清除能力越強(qiáng)，結(jié)果表明濕生扁蕾醇提取物對DPPH·清除能力最強(qiáng)。不同部位提取物清除DPPH·能力的大小順序依次為：95%乙醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。

表3 濕生扁蕾各提取物DPPH·清除率結(jié)果

2.4 清除ABTS+自由基能力測定[8]

2.4.1 ABTS工作液的制備 精密稱取ABTS 0.096 g，加25 mL蒸餾水定容得濃度為7.4 mmoL·L-1的ABTS母液。精密稱取K2S2O80.378 4 g，加10 mL蒸餾水定容得濃度為2.6 mmoL·L-1的K2S2O8母液。將5 mL 7.4 mmoL·L-1的ABTS母液與88 μL 2.6 mmoL·L-1的K2S2O8母液混勻，靜置12～16 h，配成ABTS工作液。

2.4.2 測定方法及結(jié)果 無水乙醇50 μL、ABTS工作液100 μL，記為A0管；將“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液稀釋成所需濃度并取50 μL、 ABTS工作液100 μL，記為A1管，避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測定吸光度。平行測定3次。按公式2計(jì)算各供試品ABTS+清除率和IC50值。

(公式2)

表4結(jié)果表明，濕生扁蕾各提取物對ABTS+自由基均有顯著的清除作用。IC50越小說明供試品清除能力越強(qiáng)，正丁醇提取物對ABTS+自由基清除能力最強(qiáng)。不同部位提取物清除ABTS+自由基能力的大小順序依次為：正丁醇提取物>95%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。

表4 濕生扁蕾各提取物ABTS+清除率結(jié)果

2.5 Pearson相關(guān)性分析[9]采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件將各提取物中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、木樨草素的含量與DPPH·清除能力、ABTS+清除能力進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。Pearson相關(guān)系數(shù)如表5所示，相關(guān)系數(shù)越大，表明兩者相關(guān)性越高。結(jié)果表明，各提取物的DPPH·清除能力、ABTS+清除能力與當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與當(dāng)藥黃素分別呈無直線相關(guān)和低度負(fù)相關(guān)。這表明當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量對濕生扁蕾的抗氧化活性起決定性作用。其中，DPPH·清除能力、ABTS+清除能力均與當(dāng)藥醇苷相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.994、0.823；與木犀草素相關(guān)性次之，相關(guān)系數(shù)分別為0.875、0.746。

表5 抗氧化活性與主要成分含量Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 灰色關(guān)聯(lián)分析[10]由于自由基清除率的IC50越小代表清除作用越強(qiáng)， 因此先將藥效指標(biāo) IC50值轉(zhuǎn)化為倒數(shù)，并將數(shù)據(jù)矩陣采用均值化法進(jìn)行無量綱化處理，計(jì)算IC50倒數(shù)序列與3個成分含量相關(guān)序列絕對差值數(shù)據(jù)，按照參考文獻(xiàn)中公式計(jì)算二級最大差和最小差得到關(guān)聯(lián)系數(shù)，根據(jù)關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算關(guān)聯(lián)度。具體計(jì)算過程再不贅述。關(guān)聯(lián)度與相關(guān)性呈正比，當(dāng)關(guān)聯(lián)度>0.6，則判定有相關(guān)性。如表6所示，與DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的關(guān)聯(lián)度排序均為木犀草素>當(dāng)藥醇苷>當(dāng)藥黃素，且關(guān)聯(lián)度均>0.6。其中木犀草素與DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的關(guān)聯(lián)度最高，分別為0.791、0.767；當(dāng)藥醇苷與DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的關(guān)聯(lián)度次之，分別為0.709、0.758；以上結(jié)果說明相較于當(dāng)藥黃素，木犀草素和當(dāng)藥醇苷含量對濕生扁蕾的抗氧化活性影響更大，這與文獻(xiàn)報(bào)道木犀草素和當(dāng)藥醇苷具有抗氧化作用相符合[11-12]。

表6 抗氧化活性與主要成分含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先采用HPLC法檢測了濕生扁蕾提取物中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量，不同溶劑浸出結(jié)果表明，各提取物中當(dāng)藥黃素含量為乙酸乙酯提取物>95%乙醇提取物>水提物>正丁醇提取物；當(dāng)藥醇苷含量為95%乙醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物；木犀草素含量為正丁醇提取物>95%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。其次，通過DPPH·清除實(shí)驗(yàn)、ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)考察了不同提取物的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，各提取物均有良好的抗氧化能力，但差異明顯。綜合來看以95%乙醇提取物和正丁醇提取物抗氧化能力最佳。為了驗(yàn)證各提取物中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量與抗氧化能力的相關(guān)性，采用Pearson雙變量相關(guān)分析法和灰色關(guān)聯(lián)法對當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量與其抗氧化活性進(jìn)行了相關(guān)性和關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果表明，當(dāng)藥醇苷含量與DPPH·清除能力、ABTS+清除能力相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994、0.823；而木犀草素相關(guān)系數(shù)分別為0.875、0.746。這一結(jié)果與之前的含量測定結(jié)果和抗氧化能力檢測結(jié)果相符，濕生扁蕾95%乙醇提取物和正丁醇提取物中所含當(dāng)藥醇苷和木犀草素高，其抗氧化能力越強(qiáng)，說明當(dāng)藥醇苷和木犀草素含量很有可能是濕生扁蕾發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)為濕生扁蕾體外抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定基礎(chǔ)，也為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。