張艷玲，楊 磊，劉君偉，陳人智，馬遇原，武永利，3

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是由軟骨外基質(zhì)降解與修復(fù)動(dòng)態(tài)失衡，致膝關(guān)節(jié)功能障礙的疾病?；|(zhì)金屬蛋白酶-1、13(MMP-1、13)可直接降解對(duì)軟骨基質(zhì)起支撐作用的Ⅱ型膠原，加重膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和臨床癥狀?？寡滓蜃影捉樗?10(IL-10)能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制破骨細(xì)胞破壞以減緩KOA進(jìn)展。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有免疫抑制和抗炎作用，在KOA軟骨缺損修復(fù)治療中具有重要作用，溫針灸治療KOA療效確切[1]。本實(shí)驗(yàn)探討溫針灸聯(lián)合 BMSCs 移植對(duì)KOA的治療作用，研究其效果與炎癥因子表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系：50只新西蘭大耳兔均為6月齡，體重2.5～3 kg，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2016-0007)，雌雄不分。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的動(dòng)物相關(guān)操作符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。2018年7月-2019年9月在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成實(shí)驗(yàn)操作。BMSCs(RBXMX-01001)購(gòu)自賽業(yè)生物公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模：將50只大耳兔隨機(jī)分為5組(n=10)，即：空白組(CT組)、模型組(Model組)、溫針灸組(WNM組)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(BMSCs組)、溫針灸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(WNM+BMSCs組)。除CT組外，采用右后肢伸直位石膏管型固定其余4組，固定6周以制備中期兔KOA模型，造模成功后，進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù)。

1.2 主要試劑：BMSCs完全培養(yǎng)基(賽業(yè)生物公司，批號(hào)：RBXMX-90011)；L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(Gibco)；ELISA 試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；全蛋白提取試劑盒、一抗:MMP-1、MMP-13單克隆抗體(Abcam)，山羊抗兔二抗(BOSEN)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：將購(gòu)買的P1代兔源的BMSCs培養(yǎng)在兔間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)，此后依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2～3 d換液1次。7～8 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞可達(dá)到達(dá)80%～90%融合率后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)至P3代為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.3.2 自體血小板裂解液制備：造模前將WNM組、BMSCs組兔抽取耳背靜脈血10 mL，放入含抗凝劑的離心管中，以5 000 r/min，離心20 min后獲取上層清液，分裝后于-20 ℃冰凍12 h后，保存于-80 ℃冰箱中；經(jīng)37 ℃水浴融化，再次離心(5 000 r/min，20 min)后使用。

1.3.3 BMSCs懸液制備：預(yù)熱完全培養(yǎng)基、血小板裂解液、0.25%胰蛋白酶至37 ℃，P3代BMSCs用胰酶消化3 min，鏡下見(jiàn)細(xì)胞突起回縮，形態(tài)近卵圓形時(shí)，用含血清的完全培養(yǎng)基終止消化。仔細(xì)吹打后離心5 min(1 000 r/min)，小心棄去上清液，重懸加入的自體血小板裂解液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分裝30支0.5 mL的BMSCs懸液備用。

1.3.4 治療方法與標(biāo)本收集：在相同的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，對(duì)造模成功后的各組兔給予相應(yīng)干預(yù)，1個(gè)療程7 d，共處理2個(gè)療程，5組實(shí)驗(yàn)兔于療程結(jié)束當(dāng)天同時(shí)取材。① CT組：不予處理，正常飼養(yǎng)。②Model組：僅每天固定于兔架上15 min，不做其它干預(yù)。③ WNM組：先針刺內(nèi)外膝眼、鶴頂、足三里穴，針刺得氣后，將針柄上端施加艾條(1 cm)由近端點(diǎn)燃，每個(gè)穴位施灸3壯，每日1次。④ BMSCs組：0.5 mL的BMSCs懸液(P3，1×106個(gè))通過(guò)內(nèi)膝眼向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療，每個(gè)療程注射1次。⑤WNM+BMSCs組：每個(gè)療程的第1天先通過(guò)內(nèi)膝眼向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL經(jīng)自體血小板裂解液懸浮的BMSCs(P3，1×106個(gè))，剩余6 d給予溫針灸治療。2個(gè)療程后試驗(yàn)兔耳緣靜脈空氣栓塞處死，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫血液自然凝固20 min，3 000 r/min離心5 min，仔細(xì)吸取血清放入EP試管中，保存于-70 ℃冰箱中，統(tǒng)一檢測(cè)。

1.3.5 軟骨損傷評(píng)分：對(duì)實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，依據(jù) Mankin 法[2]進(jìn)行損傷程度評(píng)分。①軟骨結(jié)構(gòu):正常，0 分；表面不平整，1 分；表面不平整且有血管翳形成，2分；裂隙進(jìn)入過(guò)渡層，3分；裂隙進(jìn)入輻射層，4分；裂隙進(jìn)入鈣化層，5分；結(jié)構(gòu)完全破壞，6 分。②軟骨細(xì)胞：正常，0 分；細(xì)胞呈彌漫性增加，1 分；局部細(xì)胞明顯增多，2 分；細(xì)胞數(shù)目明顯減少，3 分。③軟骨基質(zhì)染色：正常，0 分；輕度減少，1 分；中度減少，2 分；重度減少，3 分；無(wú)著色，4 分。④ 潮線完整性：完整性良好，0 分；完整性差，1 分。

1.3.6 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)：兔KOA血清中MMP-1和 MMP-13、IL-10的含量使用 ELISA 法檢測(cè)，具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)：提取培養(yǎng)干預(yù)后各組細(xì)胞總蛋白；按照BCA試劑盒操作步驟，配置10%的分離膠和4%的濃縮膠，對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定；經(jīng)過(guò)上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜后，加入一抗(濃度為1∶100)，4 ℃輕搖過(guò)夜；完成孵育、洗膜后，選擇與一抗來(lái)源合適的二抗工作液(濃度為1∶10 000)，室溫輕搖1 h；二抗孵育完成后再洗膜，辣根過(guò)氧化物酶 HRP-ECL 發(fā)光法曝光，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組Mankin評(píng)分比較：Model組Mankin評(píng)分高于CT組(P<0.05)；治療后WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組Mankin評(píng)分均比MX組低(P<0.05)，但比CT組升高(P<0.05)。WNM+BMSCs組Mankin 評(píng)分低于WNM組與 BMSCs 組(P<0.05)，見(jiàn)表 1。

表1 各組膝骨關(guān)節(jié)炎Mankin評(píng)分比較(分，

2.2 各組治療前后血清中MMP-1、 MMP-13和IL-10水平變化情況比較：造模成功后，與CT組對(duì)比，其余各組血清中MMP-1和MMP-13水平均明顯升高，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予各組相關(guān)干預(yù)，2個(gè)療程后與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組MMP-1和 MMP-13 均下降，而IL-10升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，且WNM+BMSCs組明顯優(yōu)于BMSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Model組治療前后血清中MMP-1和 MMP-13水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組治療前后血清中MMP-1、MMP-13和IL-10表達(dá)水平比較

2.3 采用Western blot 檢測(cè)結(jié)果比較：與CT組對(duì)比，Model組MMP-1、13蛋白的含量顯著性升高(P<0.05)；與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組MMP-1和MMP-13蛋白水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，且WNM+BMSCs組明顯低于BMSCs 組(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖1(目錄后)。

表3 各組血清中MMP-1、MMP-13蛋白含量比較

3 討論

3.1 細(xì)胞因子在KOA病理過(guò)程中的作用:KOA的發(fā)生主要與軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致KOA關(guān)節(jié)軟骨完整性破壞密切相關(guān)，軟骨細(xì)胞在炎性因子作用下凋亡，促進(jìn)KOA病情的發(fā)生進(jìn)展。MMP-1、MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，屬于膠原蛋白水解酶，作為KOA中的關(guān)鍵酶，在生物學(xué)與力學(xué)因素的影響下，可以直接作用于Ⅱ型膠原蛋白，不可逆地降解細(xì)胞外基質(zhì)。MMP-1在 OA關(guān)節(jié)軟骨退變的過(guò)程中，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成-分解代謝平衡的破壞，其水平表達(dá)的高低，直接影響著OA病理發(fā)展[3]。研究表明，MMP-1 在 兔OA模型水平表達(dá)明顯增高，其活性與軟骨退變程度呈正相關(guān)性[4-5]。潘朝旺等[6]研究表明，金蕎麥提取物可明顯下調(diào)兔模型軟骨組織MMP-1表達(dá)，減輕其對(duì)軟骨組織的降解破壞，進(jìn)一步保護(hù)軟骨組織，起到治療骨關(guān)節(jié)炎作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫針灸治療后關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-13的mRNA及蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，說(shuō)明溫針灸通過(guò)引起MMP-1、MMP-13表達(dá)下降，進(jìn)一步反向調(diào)控JNK信號(hào)通路，從而改善KOA的疼痛與關(guān)節(jié)功能障礙[7]。

IL-10主要由T細(xì)胞亞群Th2分泌產(chǎn)生，體內(nèi)所有的單核巨噬細(xì)胞作為IL-10的靶細(xì)胞，作為正向調(diào)節(jié)因子，IL-10通過(guò)促進(jìn)釋放抗炎因子，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞活性，與OA 疾病的發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)[8]。IL-10 具有重要的免疫應(yīng)答作用，當(dāng)病原體及炎癥因子侵犯人體時(shí)IL-10參與發(fā)揮機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用[9]，其水平的上調(diào)能抑制體內(nèi)過(guò)度表達(dá)和釋放炎癥因子TNF-α、IL-1，抑制炎癥反應(yīng)，起到減緩KOA關(guān)節(jié)腫脹疼痛的作用[10]。王繼猛等[11]研究發(fā)現(xiàn)弱激光照射后大鼠脊髓損傷組織內(nèi)IL-10水平增加，除外改善損傷的局部微環(huán)境，拮抗前炎癥因子引起的繼發(fā)性炎性反應(yīng)，更因增加的IL-10水平，直接表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)保護(hù)的直接作用。潘建科等[12]研究顯示，龍鱉膠囊能有效地治療KOA，消除KOA大鼠的的臨床癥狀，尤其改善大鼠KOA模型膝關(guān)節(jié)腫脹，且其產(chǎn)生的作用與升高大鼠血清IL-10水平，降低IL-1β、IL-6水平密切相關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)療程后與Model組相比，WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組軟骨降解產(chǎn)物MMP-1和 MMP-13 均下降，而抗炎因子IL-10升高，且WNM+BMSCs組治療效果明顯優(yōu)于BMSCs組及WNM組，可以在很大程度上調(diào)控炎癥因子及抗炎因子的表達(dá)水平，抑制炎癥因子表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗炎癥因子的水平增高，起到減緩抑制軟骨降解，達(dá)到治療KOA的作用。

3.2 溫針灸與BMSCs 對(duì)KOA的治療作用：KOA是中老年人常見(jiàn)高發(fā)病，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。KOA的主要病因病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”，表現(xiàn)為氣血肝腎虧虛，再感受風(fēng)寒等外邪，引起氣血不通，經(jīng)脈失養(yǎng),脈絡(luò)瘀阻而發(fā)生KOA。溫針灸是祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療KOA主要外治法，具有針刺與艾灸的雙重作用，針刺法調(diào)整氣血陰陽(yáng)平衡，活血通絡(luò)以“通則不痛”，配合灸的熱敏刺激，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到活血通絡(luò)、溫通經(jīng)脈、止痛的作用。課題組前期已證實(shí)溫針灸具有益氣養(yǎng)血、溫陽(yáng)補(bǔ)虛、散寒逐瘀的功效，所選干預(yù)穴位為雙側(cè)內(nèi)外膝眼、鶴頂、足三里，通過(guò)局部及陽(yáng)明經(jīng)取穴可加強(qiáng)膝關(guān)節(jié)周圍組織內(nèi)血液循環(huán)，加快軟骨細(xì)胞新陳代謝，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子參與的信號(hào)通路等表達(dá)，治療中遠(yuǎn)期KOA療效確切。

BMSCs具有多向分化潛能，在治療KOA中發(fā)揮許多潛能，可直接分化為軟骨細(xì)胞，參與膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)組織重建及修復(fù)損傷關(guān)節(jié)，并能夠合成生物相關(guān)活性因子，類似溫針灸局部取穴作用，使血管再生通道激活，進(jìn)而營(yíng)養(yǎng)軟骨。通過(guò)給予KOA大鼠關(guān)節(jié)腔注射BMSCs，可明顯降低大鼠血清中炎性因子的表達(dá)，可抑制因膠原表達(dá)失調(diào)所致關(guān)節(jié)軟骨組織的損害。課題組前期證實(shí)溫針灸聯(lián)合BMSCs移植可增加Ⅱ型膠原合成，通過(guò)減緩軟骨細(xì)胞凋亡而抑制兔KOA軟骨組織損傷[13]。秦豐偉[14]研究結(jié)果示BMSCs移植可降低兔KOA關(guān)節(jié)中炎癥因子IL-1、TNF-α、MMP-3的表達(dá)，升高抗炎因子IL-10水平，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)展，從而改善關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

本次試驗(yàn)應(yīng)用全貼壁法培養(yǎng)BMSCs，應(yīng)用專用培養(yǎng)基進(jìn)行純化傳代和擴(kuò)增至P3代，細(xì)胞形態(tài)長(zhǎng)梭形，單一均勻，生長(zhǎng)良好。造模后給予BMSCs組、WNM+BMSCs組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射P3代BMSCs，結(jié)果顯示兔KOA模型軟骨損傷Mankin 評(píng)分降低，關(guān)節(jié)腫脹減輕，關(guān)節(jié)功能活動(dòng)度改善，體現(xiàn)了BMSCs對(duì)兔KOA的治療作用，且下調(diào)了MMP-1、MMP-13表達(dá)，上調(diào)IL-10水平，發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，治療兔KOA 有效。WNM組、BMSCs組、WNM+BMSCs組 MMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)水平較Model組均明顯降低，且WNM+BMSCs組蛋白水平低于BMSCs組及WNM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明溫針灸與BMSCs移植聯(lián)用能夠降低軟骨細(xì)胞 MMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)水平，從而減緩軟骨基質(zhì)的降解，防治KOA的進(jìn)展。

綜上所述，溫針灸與BMSCs 移植可以降低兔KOA血清中MMP-1和 MMP-13表達(dá)，升高抗炎因子IL-10表達(dá)水平，可能通過(guò)降低因炎性介質(zhì)和因子增加而誘發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡，抑制滑膜和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，延緩軟骨退變，恢復(fù)軟骨細(xì)胞功能來(lái)治療兔KOA，與單純溫針灸和單純 BMSCs 移植治療相比，聯(lián)合使用的治療效果顯著。對(duì)于溫針灸和 BMSC 移植與炎性因子介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究完善。