王鵬達(dá)，李 貞，李西梅，張 淼，馬 寧，郝 倩，呼圣娟，劉建芳，白飛虎

目前結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率居高不下，2012年我國新發(fā)結(jié)腸癌病例約33.13萬人，死亡人數(shù)約為15.93萬人[1]。早期結(jié)腸癌預(yù)后良好，中晚期腫瘤死亡率高，這就要求更加重視臨床上的早期診斷、早期治療。近期有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有調(diào)節(jié)作用，但國內(nèi)對于其在消化道腫瘤中的研究主要集中在胃癌方面[2]。本研究通過檢測ANXA7在結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤性息肉患者以及正常人群中腸黏膜組織及外周血中的表達(dá)情況，旨在明確ANXA7的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，以明確ANXA7是否有望成為結(jié)腸癌高危人群篩查的一項腫瘤標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2019年1月-2020年1月新入住我院確診為結(jié)腸癌的患者70例作為結(jié)腸癌組，其中男37例，女33例，年齡(59±4.8)歲。選擇結(jié)腸腺瘤性息肉患者70例，其中男性35例，女性35例，年齡(58±3.6)歲。選擇健康體檢者70例作為對照組(正常腸黏膜組)，其中男性 37例，女性33例，年齡(59±3.3)歲。3組資料進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，資料具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)，即采用結(jié)腸鏡下活檢或手術(shù)切除的術(shù)后組織標(biāo)本經(jīng)病理證實為結(jié)腸癌，無其它部位原發(fā)腫瘤。結(jié)腸癌分期采用《惡性腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第七版)》[3]。結(jié)腸癌組患者采血前未進(jìn)行放療、化療及生物學(xué)治療，3組均排除患嚴(yán)重的內(nèi)科疾病。健康體檢組為腸鏡檢查正常的志愿者，并已簽署倫理委員會通過的知情同意書。

1.3 試劑及設(shè)備：本研究中主要試劑ANXA7兔抗人單克隆抗體、ELISA試劑盒以及PBS液、抗原修復(fù)液、蘇木素、DAB液均購自博奧森公司。

1.4 方法

1.4.1 采用免疫組化SP法檢測組織中ANXA7表達(dá)：分別取手術(shù)切除或腸鏡下活檢組織的結(jié)腸癌組織，結(jié)腸鏡檢查的腺瘤性息肉及正常腸黏膜組織，4%甲醛液固定標(biāo)本，使用石蠟包埋后制作切片。HE染色后顯微鏡下再次確認(rèn)診斷，之后3組均按照免疫組化法說明書操作。稀釋ANXA7兔抗人單克隆抗體工作濃度為1∶200，DAB顯色后高倍顯微鏡下判讀結(jié)果。判讀標(biāo)準(zhǔn)以著色程度和著色細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評估。隨機(jī)選擇400倍視野下5個視野觀察并計數(shù)，取其平均值，著色程度計分標(biāo)準(zhǔn)為：與陰性對照對比，無著色計為0分；淡黃色，較陰性對照著色深，計為1分，棕黃色計為2分；棕褐色，著色同陽性對照，可計為3分。著色細(xì)胞百分比計分標(biāo)準(zhǔn)為：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，>75%計為4分。兩種計分相乘得分值≥2為陽性，<2為陰性。

1.4.2 使用ELISA法檢測外周中ANXA7水平：3組研究對象均在晨起空腹采集外周靜脈血5 mL，室溫離心，血清置于-70 ℃冰箱保存。待測樣品孔中每孔加入待測樣品100 μl，每種樣品設(shè)3個平行孔；設(shè)2個陰性對照孔，每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100 μl；另設(shè)一個空白對照孔，加入純細(xì)胞裂解液100 μl。按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果：DAB顯色后觀察，ANXA7在結(jié)腸癌組織中多為陽性表達(dá)，表達(dá)部位主要在胞漿，呈棕黃色，見圖1(目錄后)。ANXA7在結(jié)腸腺瘤性息肉和正常腸黏膜組織中多為陰性或散在表達(dá)，見圖2-圖3(目錄后)。

ANXA7在結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤性息肉組以及健康體檢組中的陽性表達(dá)率分別為58.57%、20%和14.29%。在結(jié)腸癌組織中ANXA7的陽性率明顯高于結(jié)腸腺瘤性息肉組以及正常腸黏膜組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.012，P<0.05)，見表1。

表1 3組患者ANXA7表達(dá)情況的比較

2.2 ELISA結(jié)果：結(jié)腸癌組、結(jié)腸腺瘤性息肉組以及正常腸黏膜組外周血中ANXA7的水平升高，分別為(6.137±0.965)ng/mL、(2.260±0.950)ng/mL和(2.077±0.844)ng/mL，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組間兩兩比較應(yīng)用LSD法，結(jié)果顯示在結(jié)腸癌外周血中ANXA7的水平分別高于結(jié)腸腺瘤性息肉組以及正常腸黏膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)腸腺瘤性息肉組與正常腸黏膜組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 3組患者外周血中ANXA7表達(dá)水平的比較

2.3 ANXA7在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況與臨床病理特點關(guān)系：ANXA7的表達(dá)與癌塊直徑、病變部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)。不同TNM分期、病理分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ANXA7在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率不同(P<0.05)，即TNM分期偏高者，病理分化程度差、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，其ANXA7的表達(dá)陽性率相對較高，見表3。

表3 ANXA7在結(jié)腸癌組織中表達(dá)與臨床病理特點的關(guān)系[n(%)]

3 討論

膜聯(lián)蛋白(ANX)又稱會聯(lián)蛋白(Synexin)，ANX 參與細(xì)胞分裂、增殖以及磷脂酶 A2 活性的抑制、膜離子通道的形成、胞吞和胞吐、細(xì)胞間以及細(xì)胞與外基質(zhì)間的相互作用等多種生理功能[4]。膜聯(lián)蛋白A家族是一種鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白多基因家族的成員，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-6]。ANXA7屬于膜聯(lián)蛋白A家族，ANXA7基因位于人類染色體10q21上，這個區(qū)域為腫瘤抑制基因所在的區(qū)域。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析 Annexin A7 的表達(dá)情況,結(jié)果表明其在結(jié)直腸癌黏膜活檢組織中是在正常對照組中的 1.53 倍[7]。研究表明ANXA7基因?qū)δ[瘤細(xì)胞黏附分子表達(dá)及其生物學(xué)行為的影響，其可通過影響?zhàn)じ较嚓P(guān)分子FAK、Src、E-cadherin等基因與蛋白表達(dá)水平從而改變Hca-P細(xì)胞生物學(xué)行為[8]。

以往的研究主要集中在前列腺癌和腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等方面，近年發(fā)現(xiàn)ANXA7表達(dá)可作為胃癌患者預(yù)后的重要預(yù)測因素[9]。ANXA7的表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍有待研究。本研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌組織中不同TNM分期、病理分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ANXA7在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率不同(P<0.05)，即TNM分期偏高者，病理分化程度差、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，其ANXA7的陽性表達(dá)率相對較高，這提示結(jié)腸癌患者ANXA7水平與臨床病理特征有關(guān),可作為臨床評估病情的一項重要指標(biāo)。文獻(xiàn)報道ANXA7在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑素瘤和前列腺癌中有抑癌作用[10]，但有爭議的是，ANXA7在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌和乳腺癌中有促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展的作用[11]。本研究也支持ANXA7參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)腸癌組織及外周血中ANXA7的表達(dá)明顯高于結(jié)腸腺瘤性息肉組以及正常腸黏膜組，研究結(jié)果支持ANXA7有望成為結(jié)腸癌早期診斷的一項腫瘤標(biāo)記物,對于結(jié)腸癌高危人群篩查有重要意義。劉錦新等人[12]研究發(fā)現(xiàn)使用免疫組化法檢測結(jié)直腸癌組織中ANXA7的表達(dá)情況，其陽性表達(dá)高于癌旁黏膜組織，提示ANXA7在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)。本研究結(jié)果與其結(jié)果一致。但目前研究對于外周血中ANXA7的檢測在結(jié)腸癌診斷中的敏感度、特異度等問題均需要進(jìn)一步研究。