馬 雙,李金義,劉朝基,蘭福升,趙彩霞,呂 婕,楊志偉

人口腔中菌群數(shù)量有700多種，其中鏈球菌群、韋榮氏菌群、奈瑟氏菌群是口腔中最常見(jiàn)的菌群，正常菌群過(guò)度繁殖會(huì)導(dǎo)致齲齒的發(fā)生和進(jìn)展[1-2]。口腔內(nèi)溫度、濕度適宜，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源豐富，為菌斑內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供必要條件，也形成了動(dòng)態(tài)平衡菌斑微生態(tài)系統(tǒng)[3]，當(dāng)這種微生態(tài)系統(tǒng)平衡被打破，有致齲能力的產(chǎn)酸耐酸菌等增多，隨之菌斑出現(xiàn)即產(chǎn)生齲病[4]。因此，研究致齲菌與齲病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系對(duì)預(yù)防齲病的發(fā)生有重要意義[5]。而致齲菌與兒童齲病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮有報(bào)道，本文旨在探討口腔微生物菌群分布對(duì)兒童齲病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取本院2018年5月-2020年5月有齲(dmfs>6)患兒為患齲組，同期無(wú)齲(dmfs=0)患兒為對(duì)照組，每組30例?；箭x組患兒男16例，女14例，年齡3～12歲，平均年齡(7.2±2.3)歲；對(duì)照組患兒男15例，女15例，年齡2～12歲，平均年齡(6.9±2.1)歲。2組患者基礎(chǔ)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：指導(dǎo)患兒用清水漱口，采集區(qū)域用無(wú)菌生理鹽水沖洗，棉卷作隔濕處理后刮取牙菌斑，對(duì)照組刮取正常牙面牙菌斑，患齲組刮取齲齒牙面牙菌斑，置放于100 μl TE緩沖液離心管中，經(jīng)冰浴后轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃環(huán)境儲(chǔ)存。

1.2.2 菌斑DNA提?。簶颖倦x心3 min后棄上清液，參照DNA提取試劑盒(Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)方法提取。

1.2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增(V3～V5)參照該片區(qū)引物序列：341f:5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’；907r：5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’，培養(yǎng)大腸桿菌相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。PCR程序流程：95 ℃ 5 min預(yù)變形，30循環(huán)；95 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s伸延，72 ℃ 10 min伸延。

1.2.4 DGGE分析：取用5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)冰乙醇2.5倍體積壓縮沉淀，使用20 μl無(wú)菌水進(jìn)行溶解。運(yùn)用Bio-Rad公司生產(chǎn)的D-code System電泳儀行DGGE電泳分離。選用變性梯度25%～40%，濃度8%的變性梯度凝膠，1×TAE電泳緩沖液，在220 V預(yù)電泳30 min，隨后150 V持續(xù)電泳8 h，而后于溴乙錠染液染色15 min，凝膠成像儀拍照。

1.2.5 克隆測(cè)序及分析：挑選 DGGE 特異條帶，行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接T1載體，轉(zhuǎn)化后由感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)入，置于LB培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)菌液涂于IPTG及X-gal平板種培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選，分別挑選10個(gè)/每平板于LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素)接種，經(jīng)37 ℃作24 h培養(yǎng)，挑選50個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送中美泰和生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 菌群檢出率及細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定：取用20 μl 10-1、10-2、10-3樣本稀釋液，于ROGOSA及MSBA培養(yǎng)平板進(jìn)行接種，控制N2為80%、H2為10%、CO2為10%，經(jīng)37 ℃作48 h培養(yǎng)。經(jīng)肉眼可察MSBA平板典型變性鏈球菌菌落呈粗糙型、質(zhì)硬及高凸，邊緣崎嶇，表層為磨玻璃樣。經(jīng)革蘭氏染色并用油鏡查看其菌落為G+小球菌，呈鏈狀分散排列；Rogosa培養(yǎng)基上乳酸桿菌菌落呈白色，表面平滑，質(zhì)地軟、有突起，經(jīng)革蘭氏染色并用顯微鏡見(jiàn)乳酸桿菌為G+桿菌，呈長(zhǎng)、短或棒狀，可單個(gè)、成對(duì)或成串排列。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn)，即：①符合美國(guó)兒童牙科學(xué)會(huì)頒布的《2014 AAPD嬰幼兒、兒童及青少年齲齒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估管理指南》中齲病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]并經(jīng)由本院確診患兒；②年齡2～12歲；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審議通過(guò)，患兒家屬知悉同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月內(nèi)有抗生素服用史；②全身系統(tǒng)性疾病；③牙周疾病患兒。

2 結(jié)果

2.1 2組細(xì)菌菌門(mén)、菌屬占比：60例研究對(duì)象牙菌斑中共檢出細(xì)菌菌門(mén)類(lèi)5個(gè)，屬類(lèi)28個(gè)，種系型88個(gè)，見(jiàn)表1。2組門(mén)類(lèi)、屬類(lèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組門(mén)類(lèi)占比及菌屬檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組種系型67個(gè)，較對(duì)照組種系型的75個(gè)更低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 2組患兒菌門(mén)檢出率比較[n(%)]

表2 2組患兒菌屬檢出率比較[n(%)]

2.2 2組細(xì)菌基因型數(shù)目比較：患齲組經(jīng)Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)，優(yōu)勢(shì)菌屬中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌基因型數(shù)目均低于對(duì)照組(P<0.05)，變異鏈球菌及遠(yuǎn)緣鏈球菌基因型數(shù)目與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，患齲組口腔牙菌斑總基因型數(shù)目低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 2組患兒牙菌斑基因型數(shù)目比較(個(gè)，

2.3 2組四種致齲菌檢出率比較：經(jīng)Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)，患齲組遠(yuǎn)緣鏈球菌、變異鏈球菌、內(nèi)氏放線菌及黏性放線菌比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 2組四種致齲菌檢出率比較

3 討論

牙菌斑生物膜中的微生物在齲病病因?qū)W中有著重要地位，但導(dǎo)致齲病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不明確。口腔內(nèi)正常菌群因微生態(tài)環(huán)境改變而致菌群失調(diào)，是齲病發(fā)生的病因之一。本研究結(jié)果表明，60例研究對(duì)象牙菌斑中共檢出門(mén)類(lèi)5個(gè)，屬類(lèi)28個(gè)及種系型88個(gè)?；箭x組擬桿菌門(mén)、梭桿菌門(mén)占比高于對(duì)照組；放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、后壁菌屬占比則低于對(duì)照組(P<0.05)，患齲者的菌門(mén)種類(lèi)較無(wú)齲者稍有減少。在菌屬水平上，菌屬檢出率可見(jiàn)齲病組普氏菌屬檢出率是對(duì)照組的一倍，而對(duì)照組鏈球菌和韋榮菌屬檢出率略高于齲病組。二氧化碳嗜纖維菌屬及放線菌屬檢查率基本持平，這與王少果等發(fā)現(xiàn)Firmicutes和SR1菌門(mén)，Rothia、Alistipes和Catonella菌屬的存在與齲病呈負(fù)相關(guān)，Scardovia等菌屬的存在與齲病呈正相關(guān)的結(jié)論一致[7]。這可能與隨著齲齒發(fā)展，口腔牙菌斑環(huán)境進(jìn)一步發(fā)生變化，口腔整體環(huán)境pH值下降，二氧化碳嗜纖維菌屬等產(chǎn)酸、耐酸菌等成為優(yōu)勢(shì)菌屬，可適應(yīng)環(huán)境變化的細(xì)菌繼續(xù)繁衍生存，無(wú)法適應(yīng)的細(xì)菌則相應(yīng)減少有關(guān)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)在細(xì)菌檢驗(yàn)領(lǐng)域已應(yīng)用多年，其檢測(cè)高效、準(zhǔn)確[8]。本研究應(yīng)用Real-Time PCR檢測(cè)到患者口腔菌群的改變，患齲組口腔牙菌斑總基因型數(shù)目少于對(duì)照組(P<0.05)，表明齲病患者菌群多樣性是受損減少的?；箭x組牙菌斑中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌擴(kuò)增的基因型數(shù)目較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，但變異鏈球菌及遠(yuǎn)緣鏈球菌基因型數(shù)目與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明患齲組牙菌斑中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌口內(nèi)正常菌群明顯減少，但變異鏈球菌及遠(yuǎn)緣鏈球菌菌群相仿。此外，患齲組遠(yuǎn)緣鏈球菌、變異鏈球菌、內(nèi)氏放線菌及黏性放線菌比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，這可能與本研究對(duì)象為患齲兒童和健康兒童、重度低齡兒童齲患非常嚴(yán)重、口腔內(nèi)均有大量已形成的齲洞有關(guān)。故在唾液中也含有大量齲洞中的變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌，因此，菌斑中二者檢出率高于對(duì)照組。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果一致[9-10]。研究表明遠(yuǎn)緣鏈球菌數(shù)量水平雖不如變異鏈球菌，但致齲潛能高于變異鏈球菌，耐酸、產(chǎn)酸能力均增強(qiáng)，在光滑面齲病起到關(guān)鍵作用[11]，在本研究2組四種致齲菌檢出率比較中也得到了驗(yàn)證。而對(duì)放線菌屬中的內(nèi)氏放線菌及黏性放線菌數(shù)量水平分析中，患齲組內(nèi)氏放線菌及黏性放線菌數(shù)量較對(duì)照組顯著增高。其在齲齒菌斑呈酸化過(guò)程中，作為獲得性薄膜形成后的先鋒菌，促進(jìn)了牙齒表面的黏附作用，使細(xì)胞凝集能力增強(qiáng)。其數(shù)量水平可對(duì)患兒齲病嚴(yán)重程度作初步判別，在菌斑形成及齲病發(fā)生機(jī)理的了解上具有重要作用。上述關(guān)鍵致病菌的檢出是齲病兒童患齲情況的重要依據(jù)。

綜上所述，與健康兒童相比齲病患兒口腔微生物菌群多樣性減少，其中4種致齲菌遠(yuǎn)緣鏈球菌、變異鏈球菌、內(nèi)氏放線菌和黏性放線比例升高，明晰了齲病的主要致病菌種類(lèi)，為預(yù)防兒童齲病提供了一定的理論依據(jù)。