卿 華，覃佳佳，靳 燕，馬 政，姚慧鵬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014）

金虎尾目（Malpighiales）是薔薇亞綱中的一個(gè)目，包含金虎尾科（Malphigiaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、楊柳科（Salicaceae）等 36 個(gè)科，截止至2016年是APG IV系統(tǒng)中科數(shù)最多的目之一。目前已發(fā)現(xiàn)73屬，1315種，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶[1]。有關(guān)金虎尾目在薔薇亞綱中的植物學(xué)地位已經(jīng)找到了兩個(gè)主要的觀點(diǎn)。第一個(gè)觀點(diǎn)是金虎尾目與豆類的親緣性更近。2000年D.E.Soltis等人通過18s rDNA、vbcL、和atpB序列分析，將金虎尾目歸屬于豆類中的一個(gè)分支[2]，2002年APGII系統(tǒng)也認(rèn)同了這種分類[3]；2007年Zhu X.Y.等人選取了線粒體基因matR、葉綠體基因atpB、rbcL以及核基因18S rDNA分析得出COM分支（包括金虎尾目、衛(wèi)矛目、酢漿草目）與豆類存在88%的親緣性[4]；2007年 P.D.Cantino等人同樣認(rèn)為COM是豆類的一部分[5]，2009年APG III系統(tǒng)正式將金虎尾目歸屬于豆類[6]；Wang H.C.等人在2009年從COM的117個(gè)物種，59個(gè)類群中選取10條葉綠體基因使用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹得金虎尾目屬于豆類[7]；2014年B.R.Ruhfel等人從COM里9個(gè)物種篩選78條葉綠體基因構(gòu)建進(jìn)化樹得金虎尾目屬于豆類[8]；在2016年APG IV系統(tǒng)同樣將核心真雙子葉植物中薔薇類里的COM分支共歸屬于豆類[9]。第二個(gè)觀點(diǎn)是金虎尾目與錦葵類的親緣性更近。2010年Qiu Y.L.等人從COM中選取了4條線粒體基因進(jìn)行DNA序列分析得出與錦葵類更具親緣性[10]；2012年Zhang N.等人從金虎尾目中選取5條核基因通過RAxML分析得出其與錦葵類親緣關(guān)系近[11]；2014年Zeng L.P.等人利用59個(gè)基因進(jìn)行61個(gè)分類群的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金虎尾目與錦葵類親緣關(guān)系更近[12]。因此現(xiàn)在關(guān)于COM的植物分類學(xué)地位尚未查明。金虎尾目歸屬于豆類或錦葵類還是一個(gè)具有爭議的問題，本文從線粒體基因序列方面分析金虎尾目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

線粒體是植物能量代謝中最重要的細(xì)胞器之一，與葉綠體、細(xì)胞核一起組成了植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的三大攜帶者。線粒體基因具有原核起源、無組織特異性、分子小、結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)，在植物的遺傳進(jìn)化研究中有重要地位。線粒體DNA的進(jìn)化速率慢于葉綠體，并且DNA的變異率也低于葉綠體和核DNA[13]，但是線粒體DNA比兩者更穩(wěn)定，有利于分子系統(tǒng)分析。線粒體基因組堿基對的變化可以用來探究物種間的共同祖先[14]，線粒體基因有一個(gè)特點(diǎn)是在開花植物中遵循母性遺傳，因此能夠從分子領(lǐng)域研究植物線粒體同源基因的親緣性和進(jìn)化關(guān)系[15]。例如，鄧長娟等人通過線粒體基因序列變異位點(diǎn)的分析得出香蕉種間的父系系譜之間的關(guān)系[16]，孫傳清等人通過線粒體DNA分析得出普通稻和亞洲栽培稻的多態(tài)性[17]，或者是通過線粒體某一固定基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，如吳冬霞等人利用線粒體Cyt b部分基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹得出線蛺蝶亞科各主要類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[18]。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，線粒體DNA序列開始廣泛運(yùn)用于植物分子系統(tǒng)學(xué)中[19]。因此，線粒體基因的研究對生物進(jìn)化過程的分析是具有可靠的依據(jù)的，本文根據(jù)線粒體基因的特性來進(jìn)行研究。

1 材料和方法

截止至2018年11月，統(tǒng)計(jì)了GenBank上有完整線粒體基因組信息的金虎尾目、豆類、錦葵類物種的數(shù)目，其中豆類有10種，錦葵類有12種，金虎尾目有6種。由于豆類的Vigna angularis的3個(gè)基因與其他豆類，錦葵類以及金虎尾目差別巨大，因而我們最終去掉了Vigna angularis，篩選出可用的物種豆類9種，錦葵類12種，金虎尾目6種，共27種。從中篩選出其中共有的線粒體同源基因共12條，包括 atp4、atp8、ccmfc、cob、cox1、cox3、matR、nad4、nad6、nad7、nad9、rps12。以 Zhang N.等人發(fā)表的文章作為參考，以菊亞綱作為上述物種的外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[11]。

從GenBank上下載27種植物各12條線粒體同源基因，用EditSeq檢查其基因序列是否存在終止密碼子，利用Muscle對線粒體同源序列比對分析，并且手動剪切，多序列比對剪切后的結(jié)果用MEGA7.0.26分別進(jìn)行最大似然法（maximum likelihood method，ML）、最大簡約法（maximum parsimony method，MP）、近鄰法（neighbor joining method，NJ）系統(tǒng)發(fā)生分析，采取的bootstrap重復(fù)率是1 000。最后對比3個(gè)類型進(jìn)化樹是否得出一致性結(jié)論，得出金虎尾目屬于豆類還是錦葵類。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)共在27種植物種選取12條線粒體同源基因，用MEGA7.0.26分別進(jìn)行最大似然法、最大簡約法、近鄰法系統(tǒng)發(fā)生分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹的結(jié)果如下所示。

2.1 最大似然法結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中最大似然法所選用的概率模型為Tamura-Nei model，該模型考慮到核苷酸替換率的差異和核苷酸頻率的不均等，區(qū)分了嘌呤之間的過渡替代率和嘧啶之間的過渡替代率。12條同源基因用最大似然法模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果如表1，包括了分析的各線粒體基因所屬的親緣關(guān)系和與之相配應(yīng)的支持率。從表1中我們可以看出12條線粒體基因中有3條基因分析結(jié)果得金虎尾目屬于豆類，支持率為17%～52%，nad9支持率是最低的，僅有17%，支持金虎尾目屬于豆類的ccmfc和nad4的支持率雖然較高，但也未到達(dá)70%。

表1 金虎尾目在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中的匯總Table 1 Summary of the Malpighiales in ML phylogenetic tree

9條基因通過最大似然法分析結(jié)果得金虎尾目屬于錦葵類，支持率為29%～79%，有較可信支持率（BS＞70%）的基因有 atp4、cob、rps12，說明金虎尾目屬于錦葵類較為可靠。

2.2 最大簡約法結(jié)果

12條同源基因用最大簡約法模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果如表2。最大簡約法得出有8條基因表示出金虎尾目屬于錦葵類，進(jìn)化樹支持率為36%～85%，有較可信支持率:atp4的支持率為75%，cob的支持率為74%，rps12的支持率為85%。支持金虎尾目屬于豆類的僅有2條基因，nad9支持率為25%和nad4支持率為66%。此方法中出現(xiàn)了金虎尾目屬于豆類和錦葵類分支之外的情況，cox1支持率為77%，matR支持率高達(dá)了99%。在此方法中基因分析結(jié)果不一致的現(xiàn)象更明顯。

表2 金虎尾目在MP系統(tǒng)發(fā)育樹中的匯總Table 2 Summary of the Malpighiales in MP phylogenetic tree

2.3 近鄰法結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中近鄰法使用的模型是Maximum Composite Likelihood model，該模型可以準(zhǔn)確地估計(jì)成對距離和相關(guān)的替代參數(shù)。12條同源基因用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果如表3。nad7中得出2種親緣關(guān)系如圖1，從親緣關(guān)系上看來豆類僅有Ammopiptanthus mongolicus與金虎尾目類群接近，但支持率為19%?？傮w上看來，金虎尾目與錦葵目屬于一個(gè)分支，與錦葵目的關(guān)系更加親近。近鄰法表示8條基因中有14%～82%的支持率表明金虎尾目屬于錦葵類，包括nad7基因，支持率較高的是atp4達(dá)到82%。只有3條基因表明金虎尾目屬于豆類，支持率范圍較低36%～66%。此方法中也出現(xiàn)了金虎尾目屬于豆類和錦葵類分支之外的情況，圖2為基因cox1的近鄰法進(jìn)化樹結(jié)果，從進(jìn)化樹分支上看來，金虎尾目比錦葵目和豆目都先分化出來，錦葵目和豆目屬于一個(gè)分支，但支持率可信度不高，僅有44%。

表3 金虎尾目在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中的匯總Table 3 Summary of the Malpighiales in NJ phylogenetic tree

2.4 分析

通過最大似然法、最大簡約法、鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果表示不同的同源基因用不同的方法得到的支持率高低不一樣。因此根據(jù)3種方法共36個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹的支持率（不管進(jìn)化樹支持的歸屬關(guān)系，僅從支持率上看）繪制折線圖3，體現(xiàn)3種構(gòu)建進(jìn)化樹的方法對于不同的同源基因得到的支持率高低。從圖3可以看出，在不同構(gòu)建進(jìn)化樹方法中，3種方法得到的折線圖趨勢和走向大致相同，可能因?yàn)榛虻倪x擇對結(jié)果的支持率高低有關(guān)。3種方法測得的結(jié)果中都有較高可信度的基因atp4、cob、rps12，很大原因是其為較保守的基因，在進(jìn)化過程中比較穩(wěn)定。這3個(gè)基因均支持金虎尾目歸屬于錦葵類，有較高的支持率。

圖1 基因nad7近鄰法系統(tǒng)發(fā)生樹Figure 1 Phylogenetic tree of gene nad7 by nearest neighbor method

圖2 基因cox1近鄰法系統(tǒng)發(fā)生樹Figure 2 Phylogenetic tree of gene cox1 nearest neighbor method

圖3 ML、MP、NJ共27個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹支持率折線圖Figure 3 ML，MP，NJ 27 phylogenetic tree support rate broken line chart

通過3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，不同的同源基因具有不同的結(jié)果。根據(jù)3種方法共36個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹的支持率（不管所選的線粒體同源基因和3種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的差異，僅從歸屬關(guān)系上看）繪制圖4，體現(xiàn)金虎尾目歸屬關(guān)系的支持率高低分布。圖4上可看出，3種方法對于12條線粒體同源基因的的系統(tǒng)發(fā)生分析中，25個(gè)結(jié)果表明金虎尾目屬于錦葵類，8個(gè)結(jié)果表明金虎尾目屬于豆類，3個(gè)結(jié)果表明金虎尾目既不屬于錦葵類也不屬于豆類，即獨(dú)立分支。其中支持率可信（BS＞70%）的7個(gè)結(jié)果表示金虎尾目屬于錦葵類，2個(gè)支持率可信的結(jié)果表示金虎尾目屬于獨(dú)立分支，對于金虎尾目屬于豆類的結(jié)果可信度普遍不高。從總體上看，大多數(shù)結(jié)果支持金虎尾目屬于錦葵類。這與前人的研究結(jié)果基本一致。如2007年Zhu X.Y.等人利用線粒體基因matR通過最大簡約法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)金虎尾目屬于錦葵類（支持率為50%左右）[4]；2010年QIU Y.L.等人從COM中選取了4條線粒體基因atp1、matR、nad5和rps3，利用最大似然法對其進(jìn)行分析得出金虎尾目與錦葵類的親緣性更近[10]；2015年Sun M.等人對來自COM中的79個(gè)物種中4條線粒體基因（atp1、matR、nad5 和 rps3），利用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，同樣發(fā)現(xiàn)金虎尾目與錦葵類物種關(guān)系更加密切[20]。相比而言，本研究選取了12條線粒體基因，結(jié)合不同系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建方法，為這一分類觀點(diǎn)提供了更為完整和有力的證據(jù)支持。

基因matR使用最大簡約法99%的支持率表示金虎尾目獨(dú)立于錦葵類和豆類之外，即比錦葵類和豆類先分化出來?；騝ox1使用最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹有77%的支持率表示金虎尾目獨(dú)立于錦葵類和豆類，也具有可靠支持率?；騧atR和cox1進(jìn)行最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果保持一致，均支持金虎尾目獨(dú)立于錦葵類和豆類，這一證據(jù)為金虎尾目兩基因的新來源提供了另外一種可能性。

圖4金虎尾目歸屬的支持率分布Figure 4 Distribution of the support rate of the order chrysocera

3 討論與結(jié)論

3.1 異源多倍體化、雜交和基因滲入事件的發(fā)生

許多研究通過分析核基因組和質(zhì)基因組的一致性證明金虎尾目位置[4，12]，但其生物學(xué)位置還存在爭議。兩種原因?qū)е潞嘶蚪M、線粒體基因組和葉綠體基因組之間系統(tǒng)發(fā)生不一致，第一種很有可能是由于在被子植物進(jìn)化中，發(fā)生了獨(dú)立的多倍體化事件，即異源多倍體化[21]。第二種可能是被子植物在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了多次雜交和基因滲入事件使基因組不一致[22-23]。本實(shí)驗(yàn)通過分析線粒體基因系統(tǒng)發(fā)生得出選取不同的線粒體同源基因所得到的結(jié)果也存在不一致性，支持率也不相同（如圖3和圖4所示），36個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，25個(gè)結(jié)果表示金虎尾目屬于錦葵類，具有高支持率的2個(gè)結(jié)果表示金虎尾目屬于獨(dú)立分支，可能驗(yàn)證了金虎尾目植物在進(jìn)化過程中發(fā)生異源多倍體化、雜交和基因滲入事件。

3.2 不完全譜系分選的存在

由于祖先的基因隨機(jī)多態(tài)性分選和保留，單個(gè)基因位點(diǎn)的譜系關(guān)系可能對物種或種群之間的關(guān)系產(chǎn)生誤導(dǎo)或缺乏信息[24-25]。matR基因以最大簡約法有99%的支持率支持金虎尾目屬于獨(dú)立分支，其他研究中僅有不到50%的支持率表示金虎尾目屬于豆類[4]。本實(shí)驗(yàn)支持率與其他實(shí)驗(yàn)不同的原因可能是選取的樣本不同，不同的樣本間譜系關(guān)系有差異，存在不同的線粒體基因的保守程度有差異，比如金虎尾目楊柳科中3種楊樹（P.tomentasa，P.tomentasa×P.bolleana,P.alba×P.glandulasa）的線粒體基因序列高度保守[26]，較保守的線粒體基因植物樣本群與不保守的植物樣本群混合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹會使本來保守的線粒體基因樣本支持率降低。

3.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹方法的差異

近鄰法是基于距離的系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建方法，該算法每迭代運(yùn)算一次均只搜索最近的一對鄰居，對其他的匹配不考慮，可能會遺漏拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更合理的次優(yōu)樹[27]。最大簡約法通過搜索可能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來尋找最優(yōu)樹，適用于分析某些特殊分子數(shù)據(jù)如插入、缺失等序列，當(dāng)序列存在較多回復(fù)突變和平行突變時(shí)，則很可能得到錯誤的系統(tǒng)發(fā)生樹。最大似然法基于概率模型，考慮所有可能的突變路徑，尋找最高概率發(fā)生的系統(tǒng)發(fā)生樹，但是對概率模型過于依賴。本實(shí)驗(yàn)使用的3種系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建方法中，準(zhǔn)確度由高到低排列:最大似然法、最大簡約法、近鄰法，通常使用兩種以上不同的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，當(dāng)結(jié)果基本一致時(shí)，較為可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示不同的方法得到的系統(tǒng)發(fā)生樹和支持率有差異（如圖4所示），原因可能是因?yàn)?種構(gòu)樹方法的算法存在差異，但得到的系統(tǒng)發(fā)生樹大多數(shù)都支持金虎尾目屬于錦葵類，支持率較高。