章孝成，丁 銳，張曉燕，韓毛振，黃升海,

乳糖不耐受癥(lactose intolerance，LI)是由機體內(nèi)乳糖酶缺乏所引起，癥狀為腹部不適、脹氣、和腹瀉等。LI是由于機體內(nèi)乳糖酶缺乏而引起的腹部不適、脹氣和腹瀉等臨床癥狀。目前LI是影響兒童營養(yǎng)不良、發(fā)育遲緩的重要疾病，全球許多人群面臨不同程度的LI，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1-2]。繼發(fā)性乳糖不耐受(secondary lactose intolerance, SLI)是一種暫時性LI，常繼發(fā)于腸道各種病毒或寄生蟲感染性疾病、克羅恩病或放射性腸炎等，使腸絨毛受損傷而出現(xiàn)乳糖酶的缺乏，發(fā)生LI腹瀉；待絨毛恢復(fù)能分泌足量乳糖酶后疾病有所恢復(fù)[3]。目前，SLI的發(fā)生機制研究并不完善，主要原因是缺乏相關(guān)的SLI動物模型。該文通過構(gòu)建輪狀病毒(rotavirus,RV)感染7日齡BALB/c乳鼠SLI模型，為SLI的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與病毒株恒河猴胚胎腎細(xì)胞MA104細(xì)胞株、輪狀病毒VR-2018病毒株均購自武漢病毒研究所，課題組自行培養(yǎng)保存。病毒復(fù)蘇后在MA104細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)增殖，通過半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(median tissue culture infective dose，TCID50)測定感染劑量為10-4.51/0.1 ml后，用于灌胃感染乳鼠。

1.2 實驗動物SPF級1～8周齡BALB/c小鼠36只，由安徽省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于獨立送風(fēng)隔離籠具系統(tǒng)內(nèi)，該系統(tǒng)由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物房提供，等級為P2級。待雌雄鼠自行配種生產(chǎn)乳鼠，隨機選取150只7日齡BALB/c乳鼠，3.5 ～4.0 g/只。

1.3 主要試劑DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號：1868817)；小牛血清購自蕪湖天明生物技術(shù)有限公司(批號：C0257)；二甲基亞砜購自美國biosharp公司(批號：D5879)；乳糖酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所公司(批號：A082-1)；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號：15596-026)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自北京全式金公司(批號：AH311-02、AE411-02)；其他各種規(guī)格的培養(yǎng)板購自美國Falcon公司。

1.4 RV增毒及感染劑量測定MA104細(xì)胞經(jīng)0.2%EDTA、0.25%胰蛋白酶消化后反復(fù)吹打混勻，制成5×105/ml細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1 ml/孔，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中生長24 h后，細(xì)胞單層達(dá)90%融合，吸棄培養(yǎng)液，用無血清MEM培養(yǎng)液洗滌2次；每孔加入100 μl含7 μg/ml胰酶的無血清MEM培養(yǎng)液，再加100 μl病毒懸液混勻，37 ℃培養(yǎng)吸附1 h，每隔20 min取出搖勻一次；吸棄接種液，細(xì)胞用無血清MEM洗滌2次后加入1 ml含7 μg/ml胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒。收獲的病毒懸液10倍連續(xù)稀釋，經(jīng)TCID50測定，RV病毒懸液中感染性病毒為1×10-4.51/0.1 ml。

1.5 RV感染模型的建立將BALB/c乳鼠隨機分為3組：實驗感染組、PBS陰性對照組和正常對照組，每組5只，實驗感染組、PBS陰性對照組采用灌胃的方式接種，其中實驗感染組接種TCID50為1×10-4.51/0.1 ml RV病毒懸液，200 μl/只，PBS陰性對照組接種等體積PBS溶液，正常組對照組不接種任何試劑，乳鼠于接種前后各饑餓2 h，每天觀察乳鼠的腹瀉情況。

1.6 樣本的收集及檢測接種后每日處死乳鼠，無菌取乳鼠小腸組織，通過qPCR方法檢測病毒增殖水平，HE染色和乳糖酶活力檢測，觀察及檢測乳鼠小腸組織中RV的含量及其組織病理變化。

1.7 qRT-PCR法收取乳鼠小腸組織，預(yù)冷PBS洗滌3次后用TRIzol試劑提取總RNA，測定其純度和濃度后，按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和操作；靶cDNA按照TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒操作說明書配置RT-PCR反應(yīng)體系和操作。以GAPDH為本實驗的內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列及擴增片段長度

1.8 乳糖酶活力測定取新鮮的乳鼠腸組織勻漿，并測定其蛋白濃度，設(shè)立空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管和對照管4個實驗管，各管先加入50 μl底物，空白管加入25 μl雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)管加入25 μl濃度為5.55 mmol/L葡萄糖液，測定管加入25 μl乳鼠腸組織勻漿液，對照管不加任何物質(zhì)，混均，37℃孵育20 min后各試驗管加入25 μl終止劑，對照管加入與測定管相對應(yīng)的25 μl乳鼠腸組織勻漿液，各試驗管混均，4000 r/min離心10 min，取上清液備用，取96孔酶標(biāo)板，加入8 μl上述的各試驗管的上清液，每個試驗管設(shè)立兩個復(fù)孔，每孔加入200 μl顯色劑，輕輕震蕩孔板，37℃孵育15 min后，酶標(biāo)儀505 nm處讀取各孔吸光度(optical density, OD)值。通過公式：乳糖酶的活力(U/ mgprot )=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5.55 mmol/L)/反應(yīng)時間(20 min)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)×1 000

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計差異分析，實驗數(shù)據(jù)均數(shù)通過One way ANOVA即單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RV的增殖輪狀病毒VR-2018株感染正常MA104細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)增殖，病變細(xì)胞隨著病毒不斷復(fù)制和增殖而加重，細(xì)胞出現(xiàn)貼壁能力減弱、大量圓縮、懸浮、變形和破裂等現(xiàn)象，見圖1。

圖1 正常MA104細(xì)胞和RV感染的MA104細(xì)胞 ×400A：正常MA104細(xì)胞；B：RV感染的MA104細(xì)胞

2.2 qPCR檢測乳鼠小腸組織內(nèi)RV相對含量小腸組織中RV NSP5基因通過熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，RV感染第一天在小腸組織中即可檢測到，RV NSP5基因的mRNA表達(dá)含量呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢，前4 d在小腸組織中病毒的表達(dá)水平均較高，其中第二天最高(P=0.0174，F(xiàn)=13.69)，感染第7天以后相對表達(dá)水平很低，見圖2。

圖2 實驗組乳鼠小腸組織RV NSP5基因mRNA表達(dá)

2.3 乳鼠攻毒后的腹瀉情況乳鼠攻毒后每隔24 h觀察其體征和腹瀉情況，連續(xù)觀察10 d并記錄。按壓乳鼠腹部產(chǎn)生應(yīng)激排便，通過糞便的形態(tài)判斷腹瀉情況，腹瀉的評分參考標(biāo)準(zhǔn)分成3個等級：未腹瀉、普通腹瀉和嚴(yán)重腹瀉，通過觀察乳鼠糞便形態(tài)進(jìn)行分級，未腹瀉：無便或正常固體糞便，記為0分或1分；普通腹瀉：黃色顆粒狀便，記為2分；嚴(yán)重腹瀉：軟便或水樣便，記為3分。通過觀察，正常對照組無腹瀉情況，實驗感染組感染后前3 d出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，腹瀉持續(xù)約7 d左右。見圖3。

圖3 乳鼠腹瀉結(jié)果

2.4 乳鼠小腸外觀性狀解剖乳鼠觀察小腸組織外觀性狀：PBS陰性對照組和正常對照組小腸完整，表面光滑透亮；實驗感染組小腸色澤較正常對照組灰暗，小腸上皮有很多出血點，見圖4。

圖4 乳鼠小腸外觀性狀A(yù)：正常對照組；B：PBS陰性對照組；C：實驗感染組

2.5 乳鼠小腸組織切片HE染色取實驗感染組，正常對照組和PBS陰性對照組小腸組織進(jìn)行HE染色。正常對照組和PBS陰性對照組整體狀態(tài)一致，小腸各層結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞胞質(zhì)致密，絨毛排列整齊完整；實驗感染組乳鼠腸組織出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為空泡，細(xì)胞水腫，有炎性細(xì)胞浸潤，小腸絨毛中分布的血管擴張充血，絨毛出現(xiàn)破損雜亂，絨毛長度較對照組變短。見圖5。

2.6 乳糖酶活力檢測與正常對照組比較，實驗感染組的乳糖酶活力在前4 d逐漸降低，第2天開始，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0173，F(xiàn)=11.26)，在第4天達(dá)到最低(P<0.01，F(xiàn)=15.88)，第5天后逐漸恢復(fù)到正常對照組水平。見圖6。

圖5 BALB/c乳鼠小腸組織 HE ×400

圖6 實驗組乳鼠小腸組織乳糖酶活力檢測

3 討論

RV是引起全球范圍內(nèi)兒童腹瀉的主要病原體，主要經(jīng)消化道傳播，是導(dǎo)致SLI的原因之一[4]。目前，關(guān)于RV導(dǎo)致腹瀉的動物模型相關(guān)報道很多，如牛、狗、豬、兔、羊和鼠等，其中由于鼠易獲得、易飼養(yǎng)、繁殖能力強等優(yōu)點在很多的動物模型中被廣泛應(yīng)用[5]。RV感染人體后在機體腸道的小腸上皮絨毛上端復(fù)制，使得腸上皮基底膜中粘連蛋白疏松，導(dǎo)致細(xì)胞間連接緊密性下降、小腸上皮微絨毛細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，乳糖酶活性表達(dá)下降，進(jìn)而引起腹瀉等一系列臨床癥狀。BALB/c乳鼠因動物體質(zhì)量輕，易獲得，所用的病毒劑量小，實驗成本低，適合批量建模；BALB/c乳鼠能夠模擬嬰幼兒RV感染急性腸炎的臨床特征，可快速構(gòu)建病毒感染動物實驗?zāi)Ｐ停瑢嶒灧€(wěn)定性好，可重復(fù)。RV病毒感染方式為糞-口途徑傳播，故本實驗采用灌胃感染病毒，為排除人為操作等因素對小鼠機體損傷的干擾,設(shè)置PBS陰性對照組表明實驗的科學(xué)性與嚴(yán)謹(jǐn)性。RV感染后前3 d出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，腹瀉約持續(xù)7 d左右，對照組陰性，表明病毒的感染能導(dǎo)致乳鼠腹瀉。HE染色結(jié)果顯示RV感染小腸組織后，小腸組織損傷、小腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)水腫等炎癥反應(yīng)，從病理學(xué)角度證明RV感染會導(dǎo)致小腸組織發(fā)生炎癥，進(jìn)而引起位于腸上皮細(xì)胞刷狀緣上端的乳糖酶活性降低。通過乳鼠小腸組織乳糖酶活性檢測，表明RV感染后會影響到乳糖酶活性且使其降低。乳鼠乳糖酶活性的降低和出現(xiàn)腹瀉臨床癥狀表明乳鼠產(chǎn)生SLI。從病理結(jié)構(gòu)來看，乳糖酶的活性和數(shù)量在空腸中最高，而RV主要侵襲小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣上端，使得腸上皮細(xì)胞發(fā)生空泡化，出現(xiàn)水腫和絨毛斷裂脫落的現(xiàn)象，致使小腸黏膜損傷，小腸組織結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重影響到小腸黏膜吸收水分和電解質(zhì)功能，從而引起腹瀉且使得乳糖酶的數(shù)量和活性降低[6-7]。本課題組的模型研究結(jié)果與之一致。