梁書卿，魏 楓，孫洪莉，鄭 朦，王曉艷，李冉浩，馬玉博

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在過(guò)去幾十年的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。腫瘤的發(fā)生涉及基因的多種復(fù)雜變化及基因表型的改變，其中，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用，DNA甲基化是一種由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)介導(dǎo)的化學(xué)修飾，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。死亡相關(guān)蛋白激酶基因(death-associated protein kinase，DAPK)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生，但在甲狀腺乳頭狀癌上少有報(bào)道，是目前研究的熱點(diǎn)之一[5-6]。因此，抑制DNMTs可能作為治療甲狀腺癌的靶點(diǎn)，5-Aza-CdR是一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，研究[7-8]顯示該藥已經(jīng)成功作用于肺癌、白血病等腫瘤，而在甲狀腺癌中作用尚不清楚。該文以甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系及甲狀腺正常細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過(guò)體外給予5-Aza-CdR來(lái)觀察細(xì)胞系中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA和蛋白表達(dá)的情況，為研究甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人正常甲狀腺細(xì)胞(Nthy-ori-3)、人甲狀腺乳頭狀細(xì)胞(TPC-1)均購(gòu)自復(fù)旦細(xì)胞庫(kù)；去甲基化制劑5-Aza-CdR購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司；一抗GAPDH、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B均購(gòu)自美國(guó)CST公司；DAPK抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗兔辣根過(guò)氧化酶(HRP)Ig G二抗購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司；引物均由上海生物技術(shù)公司合成；RealSYBR Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1Nthy-ori-3、TPC-1細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞模型的制備 Nthy-ori-3、TPC-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37 ℃、 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿或孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)Nthy-ori-3、TPC-1細(xì)胞，待其狀態(tài)穩(wěn)定，形態(tài)飽滿，達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，融合度約為60%～70%時(shí)換液，實(shí)驗(yàn)組加入10 μmol/L的5-Aza-CdR，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為甲狀腺正常細(xì)胞未加藥組Nthy-ori-3(-)、甲狀腺正常細(xì)胞加藥組Nthy-ori-3(+)、甲狀腺乳頭狀癌未加藥組TPC-1(-)、甲狀腺乳頭狀癌加藥組TPC-1(+)，繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2Real-time PCR檢測(cè)各組DAPK及DNMTs的mRNA表達(dá) 采用TRIzol 法提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop-2000檢測(cè)提取的RNA濃度，使用Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書操作進(jìn)行DNA反轉(zhuǎn)錄，在ABI7900上進(jìn)行Real-time PCR，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系均為：Mix 10 μl，cDNA 2 μl；上下游引物各0.5 μl；去離子水7 μl；擴(kuò)增均在不同的管中進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s(DAPK:59℃，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B：60℃，GAPDH：59℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃繼續(xù)5 min讓反應(yīng)充分，4 ℃暫時(shí)保存，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，目標(biāo)基因的CT值通過(guò)GAPDH的CT值均一化，即ΔCT=CT目標(biāo)-CTGAPDH，而目標(biāo)基因mRNA相對(duì)豐度值以 ΔΔCT 值(DD value)表示，ΔΔCT=2-ΔCT。通過(guò)比較各組目標(biāo)基因 ΔΔCT，分析其表達(dá)的變化。

表1 熒光定量RCR引物序列

1.2.3Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組DAPK及DNMTs的蛋白表達(dá) 收集藥物作用前后的細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))裂解細(xì)胞，提取各組蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)提取蛋白的濃度。20 μg蛋白定量，用SDS-PAGE(5%～10%)分離，再轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入一抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，再在與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h。每步完成都要用TBST洗滌3次，每次10 min。ECL發(fā)光液處理，圖像通過(guò)Tanon-5800成像系統(tǒng)獲得，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR上機(jī)實(shí)驗(yàn)加樣上機(jī)進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增曲線不同顏色代表4個(gè)分組：甲狀腺正常細(xì)胞未給藥組Nthy-ori-3(-)、甲狀腺正常細(xì)胞給藥組Nthy-ori-3(+)、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組TPC-1(-)、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞給藥組TPC-1(+)，曲線共同抬頭于第20循環(huán)，反應(yīng)良好，見(jiàn)圖1。

圖1 Real-time PCR擴(kuò)增曲線圖

2.2 Real-time PCR分析各組DNMTs mRNA的表達(dá)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA表達(dá)水平以GAPDH mRNA為內(nèi)參得到各組相對(duì)值，與正常甲狀腺細(xì)胞未給藥組相比，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組的DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA的表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組相比，甲狀腺乳頭狀癌給藥組經(jīng)5-Aza-CdR處理48 h后，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA 表達(dá)量均下降(F=9.381、17.009、4.867，P=0.005、0.001、0.033)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 Real-time PCR分析各組DAPK mRNA的表達(dá)Real-time PCR結(jié)果顯示，各組DAPK mRNA的表達(dá)存在差異(F=10.790,P=0.003)。在人正常甲狀腺細(xì)胞中DAPK表達(dá)甚少，且加藥后無(wú)改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.999)；甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理48 h后，DAPK基因mRNA的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。見(jiàn)圖3。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.4 Western blot分析各組DNMTs蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，各組DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白水平表達(dá)存在差異(F=7.642,P=0.010;F=4.983,P=0.031;F=13.446,P=0.002)。正常甲狀腺細(xì)胞無(wú)論給藥前后，DNMTs的蛋白表達(dá)均無(wú)差異(P>0.05)。與人正常甲狀腺細(xì)胞未給藥組相比，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組相比，5-Aza-CdR處理48 h后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 DAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 Western blot分析各組DAPK基因蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，各組DAPK蛋白表達(dá)水平存在差異(F=7.954;P=0.009)。在正常甲狀腺細(xì)胞中抑癌基因DAPK蛋白有表達(dá)，且加藥前后無(wú)改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.485)；與正常甲狀腺細(xì)胞未給藥組相比，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞未給藥組抑癌基因DAPK蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)，經(jīng)5-Aza-CdR處理48 h后，人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中DAPK基因蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。見(jiàn)圖5。

3 討論

DAPK最早發(fā)現(xiàn)于1995年，是一種鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與凋亡、自噬和炎癥等多種細(xì)胞過(guò)程[9-10]，是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子之一。Jing et al[11]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制miR-34a-5p阻止p53-DAPK軸的破壞，上調(diào)DAPK的表達(dá)，從而抑制腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展。DAPK作為一種腫瘤抑制基因，其啟動(dòng)子區(qū)域GpG島的高甲基化致使基因轉(zhuǎn)錄沉默而失去功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已經(jīng)在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動(dòng)子區(qū)域因不同程度的高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)低。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 目前已知有3種DNMT(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)參與了DNA的甲基化修飾過(guò)程,DNA 啟動(dòng)子區(qū)域GpG島甲基化后并不會(huì)改變核酸的序列，只是部分堿基發(fā)生甲基化的修飾，因此基因的甲基化是一種可以被逆轉(zhuǎn)的表觀遺傳學(xué)修飾過(guò)程。使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)啟動(dòng)區(qū)域的高甲基化，使DAPK重新表達(dá)[12-13]。徐雅娣 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1抑制劑通過(guò)調(diào)控增殖及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。5-Aza-CdR是一種典型DNMT抑制劑，已經(jīng)有研究[12，15-16]報(bào)道5-Aza-CdR通過(guò)沉默甲基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)肺癌、乳腺癌、食管癌等細(xì)胞株的DAPK mRNA的重新表達(dá)。但是目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作用在人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株DAPK基因表達(dá)影響的相關(guān)報(bào)道。研究顯示甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1中DNMTs表達(dá)上調(diào)，其抑癌基因DAPK的表達(dá)水平很弱。使用去甲基化藥物5-Aza-CdR處理TPC-1細(xì)胞后，DNMTs的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，而DAPK的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，提示5-Aza-CdR可能通過(guò)沉默甲基轉(zhuǎn)移酶而降低抑癌基因DAPK啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平從而誘導(dǎo)其重新表達(dá)。

圖4 Western blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖5 Western blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組DAPK的蛋白相對(duì)表達(dá)量

綜上所述，本研究結(jié)果表明DNMTs表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)影響甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞抑癌基因DAPK的過(guò)度甲基化，使其轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程沉默，促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展，5-Aza-CdR可以通過(guò)沉默甲基轉(zhuǎn)移酶而誘導(dǎo)DAPK 的重新表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的防治作用。