柯 超，蔣 斌，周紅見，李全富

胃癌在全球范圍內(nèi)均有較高的致死率，胃癌細胞的無限增殖和局部、遠處轉(zhuǎn)移是預(yù)后不佳的主要原因[1]，然而，胃癌增殖侵襲機制的研究尚無突破性進展。大量證據(jù)[2-3]表明，miRNA在多種癌癥中存在表達異常，可能參與細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程。因此，識別腫瘤特異性miRNA，將有利于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后。據(jù)報道[4]，miR-381在胃癌中低表達，可調(diào)控LRH-1、Twist1表達抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。調(diào)控跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)屬于鈣離子激活的氯離子通道蛋白，參與細胞信號轉(zhuǎn)導、平滑肌收縮等[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。該研究旨在明確miR-381和TMEM16A的靶向關(guān)系，觀察miR-381是否通過TMEM16A影響胃癌細胞AGS生物學行為，為胃癌的治療提供有效分子靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1組織 選取2018年3月—2019年3月行手術(shù)切除的胃癌患者34例，采集其癌組織及癌旁正常組織(距癌低于3 cm)，組織樣本保存于液氮罐中；患者經(jīng)術(shù)后病理檢測確診為胃癌，知情且同意本次采集，本研究經(jīng)武漢市第三醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2細胞株 胃癌細胞AGS、MKN45、SGC7901和正常人胃黏膜細胞GES-1購自上海生物細胞研究所，胃癌細胞的生物學特性見表1。

表1 胃癌細胞AGS、MKN45、SGC790的生物學特性

1.2 主要試劑與儀器胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMSO(美國Gibco公司)，引物序列由江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成，脂質(zhì)體3000試劑盒(美國Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司),熒光素酶報告系統(tǒng)(美國Promega公司),MTT粉末(上海廣銳生物科技有限公司),FITC-Annexin V/PI試劑盒(德國Miltenyi公司),Transwell小室(上海子起生物科技有限公司),蛋白一抗(美國Cell Signaling公司),細胞培養(yǎng)箱(上海軒儀儀器設(shè)備有限公司),qRT-PCR儀(美國BioRad公司),流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育；待細胞融合至80%～90%時，消化傳代培養(yǎng)；取生長狀況良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2細胞分組與轉(zhuǎn)染 將AGS細胞分為空白對照組、miR-381過表達組(miR-381-mimics)、TMEM16A干擾組(TMEM16A-siRNA)，采用脂質(zhì)體3000試劑盒，分別將miR-381-NC、miR-381-mimics、TMEM16A-siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞，采用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，篩選轉(zhuǎn)染效率在60%的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3qRT-PCR檢測組織和細胞中miR-381和TMEM16A mRNA的表達 采用TRIzol法提取組織、細胞中的總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，混入熒光染料后進行qRT-PCR，采用2-ΔΔCt法，以U6為內(nèi)參定量，計算miR-381的表達；以GADPH為內(nèi)參定量，計算TMEM16A mRNA的表達。各基因引物序列[7-8]見表2，作5次獨立重復(fù)實驗。

表2 基因引物序列

1.3.4雙熒光素酶實驗 應(yīng)用生物信息學預(yù)測軟件TargetScan3.1對miR-381和TMEM16A的靶向關(guān)系進行預(yù)測；根據(jù)預(yù)測結(jié)果，合成含有結(jié)合位點DNA片段的野生型(wild type，wt)以及含有結(jié)合位點突變體DNA片段的突變型(mutant，mut)，構(gòu)建熒光素酶報告載體；采用脂質(zhì)體3000試劑盒，將TMEM16A 3′-wt、TMEM16A 3′-mut及miR-381-mimics轉(zhuǎn)染AGS細胞，培養(yǎng)48 h后檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.3.5MTT法檢測細胞增殖 將各組細胞接種至96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄液后加入DMSO，輕微震蕩6 min，于570 nm處檢測各孔吸光度(optical density，OD)值，OD值越大表明細胞密度越大。

1.3.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組細胞，重懸于孵育緩沖液，離心后加入FITC-Annexin V和PI染液混勻，室溫下避光反應(yīng)5 min；孵育緩沖液清洗后，加入熒光SA-FLOUS溶液，避光條件下4 ℃孵育 20 min；應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。散點圖結(jié)果：左下象限(FITC-/PI-)顯示活細胞，右上象限FITC+/PI+)為壞死細胞，右下象限(FITC+/PI-)為凋亡細胞。

1.3.7Transwell小室法檢測細胞侵襲 將基質(zhì)膠包裹Transwell小室，凝固后接種各組細胞于上室，并在下室中接入含20%的RPMI1640培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h后，吸棄Transwell小室上室中培養(yǎng)液，并拭去膜內(nèi)側(cè)多余細胞；取出小室固定于4%多聚甲醛中，反應(yīng)20 min；滴加DAPI染色，于顯微鏡下觀察、計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.3.8Western blot檢測細胞中蛋白的表達 收集各組細胞，加入裂解液充分提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度，各組取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別加入相應(yīng)蛋白一抗(1 ∶1 000)于4 ℃過夜，再置于 HRP標記的二抗(1 ∶8 000)中37 ℃反應(yīng)1 h；最后滴加ECL發(fā)光顯示蛋白條帶，應(yīng)用Image J軟件灰度分析各蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，計算含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3、caspase-9)、E鈣黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP-2、MMP-9)的表達量(目標蛋白表達量=目標蛋白灰度值均值/β-actin灰度值均值)。

2 結(jié)果

2.1 不同組織和細胞中miR-381和TMEM16A mRNA表達的比較采用TRIzol法提取不同組織和細胞中的總RNA，用qRT-PCR分析miR-381和TMEM16A mRNA的相對表達水平，結(jié)果顯示，胃癌組織miR-381的相對表達水平為0.37±0.06，癌旁正常組織為0.82±0.12；與癌旁正常組織相比，胃癌組織中miR-381表達降低(t=19.558，P<0.001)。胃癌細胞AGS、MKN45、SGC7901和正常細胞GES-1中miR-381相對表達水平分別為0.29±0.05、0.47±0.09、0.82±0.07和1.00±0.11，差異有統(tǒng)計學意義(F=75.676，P<0.001)；與人正常胃黏膜細胞GES-1相比，胃癌細胞AGS、MKN45、SGC7901中miR-381表達均下降(qAGS=19.113，P<0.001；qMKN45=14.267，P<0.001；qSGC7901=4.845，P=0.004)。

胃癌組織TMEM16A mRNA的相對表達水平為0.98±0.12，癌旁正常組織為0.30±0.07；與癌旁正常組織相比，胃癌組織中TMEM16A mRNA表達升高(t=28.541，P<0.001)。胃癌細胞AGS、MKN45、SGC7901和正常細胞GES-1中TMEM16A mRNA相對表達水平分別為1.65±0.15、1.32±0.10、1.19±0.14和1.00±0.12，差異有統(tǒng)計學意義(F=22.516，P<0.001)；與人正常胃黏膜細胞GES-1相比，胃癌細胞AGS、MKN45、SGC7901中TMEM16A mRNA表達均升高(qAGS=11.272，P<0.001；qMKN45=5.550，P=0.003；qSGC7901=3.295，P=0.033)。

2.2 過表達miR-381對AGS細胞中miR-381和TMEM16A mRNA表達的影響將miR-381-mimics、TMEM16A-siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞，經(jīng)流式細胞儀測得轉(zhuǎn)染效率分別為62.37%和65.38%，可用于后續(xù)實驗；采用TRIzol法提取各組細胞中的總RNA，用qRT-PCR分析miR-381和TMEM16A mRNA的相對表達水平，結(jié)果如表3所示，與空白對照組相比，miR-381-mimics組細胞中miR-381的表達上升(q=94.524，P<0.001)， TMEM16A mRNA表達下降(q=16.045，P<0.001)；TMEM16A-siRNA組TMEM16A mRNA表達下降(q=26.407，P<0.05)，但miR-381的表達無變化(q=0.247，P=0.864)；聯(lián)合轉(zhuǎn)染組miR-381的表達上升(q=92.300，P<0.001)，但與miR-381-mimics組比較無差異(q=2.224，P=0.136)，TMEM16A mRNA表達下降(q=29.415，P<0.001)，且明顯低于miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組(qmiR-381-mimics=13.371，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=3.008，P=0.049)，詳見表3。miR-381-mimics對TMEM16A mRNA的沉默效率為(46.6±1.8)%，TMEM16A-siRNA對TMEM16A mRNA的沉默效率為(76.3±2.4)%，miR-381-mimics聯(lián)合TMEM16A-siRNA對TMEM16A mRNA的沉默效率為(85.4±2.1)%。

表3 各組細胞中miR-381和TMEM16A mRNA表達的比較

2.3 miR-381和TMEM16A靶向關(guān)系應(yīng)用TargetScan3.1軟件預(yù)測miR-381和TMEM16A的靶向關(guān)系，可能的結(jié)合位點如圖1所示；根據(jù)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建熒光素酶報告載體驗證靶向關(guān)系。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，TMEM16A 3′-wt對照組細胞中熒光素酶活性為1.00±0.11，而共轉(zhuǎn)染TMEM16A 3′-wt和miR-381-mimics組為0.37±0.07，其熒光素酶活性低于TMEM16A 3′-mut對照組(t=10.804，P<0.001)；TMEM16A 3′-mut對照組細胞中熒光素酶活性為0.98±0.08，共轉(zhuǎn)染TMEM16A 3′-mut和miR-381-mimics組為1.03±0.10，與TMEM16A 3′-mut對照組比較無差異(t=0.329，P=0.751；t=0.451，P=0.664)，證實miR-381和TMEM16A的靶向關(guān)系。

圖1 miR-381和TMEM16A預(yù)測結(jié)合位點

2.4 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞增殖的影響采用MTT法檢測各組細胞的增殖活性，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組細胞增殖明顯被抑制，具體OD值見表4；采用Western blot法檢測各組細胞中p27的相對表達量，結(jié)果如圖2所示，空白對照組、miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組p27的相對表達量分別為1.00±0.11、1.29±0.13、1.34±0.12及1.56±0.14，差異有統(tǒng)計學意義(F=16.854，P<0.001)；與空白對照組相比，其余各組p27的表達均增加(qmiR-381-mimics=5.167，P=0.002；qTMEM16A-siRNA=6.058，P=0.002；q聯(lián)合組=9.978，P<0.001)。

表4 各組細胞OD570nm值的比較

圖2 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞中p27表達的影響

1：空白對照組；2：miR-381-mimics組；3：TMEM16A-siRNA組；4：聯(lián)合組

2.5 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞凋亡的影響采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，結(jié)果顯示，空白對照組、miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組細胞凋亡率分別為(3.41±0.82)%、(13.54±2.51)%、(16.78±3.16)%及(22.37±3.58)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=42.574，P<0.001)；與空白對照組相比，miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組細胞凋亡率明顯增加(qmiR-381-mimics=8.302，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=10.958，P<0.001；q聯(lián)合組=15.539，P<0.001)。采用Western blot法檢測各組細胞中caspase-3、caspase-9的相對表達量，結(jié)果如圖3、表5所示，與空白對照組相比，其余各組細胞中caspase-3、caspase-9的相對表達量明顯增加(caspase-3：qmiR-381-mimics=5.912，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=6.651，P<0.001；q聯(lián)合組=9.791，P<0.001。caspase-9：qmiR-381-mimics=3.367，P=0.030；qTMEM16A-siRNA=5.316，P=0.005；q聯(lián)合組=8.505，P<0.001)。

圖3 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞中caspase-3、caspase-9表達的影響

2.6 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞侵襲的影響采用Transwell小室法檢測各組細胞侵襲能力，結(jié)果顯示，空白對照組、miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組侵襲細胞數(shù)分別為(186.25±22.47)個、(83.46±16.72)個、(41.96±14.08)個及(25.34±6.57)個，差異有統(tǒng)計學意義(F=101.790，P<0.001)；與空白對照組相比，miR-381-mimics組、TMEM16A-siRNA組及聯(lián)合組侵襲細胞數(shù)明顯下降(qmiR-381-mimics=14.352，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=20.147，P<0.001；q聯(lián)合組=22.467，P<0.001)。采用Western blot法檢測各組細胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的相對表達量，結(jié)果如圖4、表6所示，與空白對照組相比，其余各組細胞中Vimentin、MMP-2及MMP-9的表達明顯下降(Vimentin：miR-381-mimics=4.002，P=0.012；qTMEM16A-siRNA=8.804，P<0.001；q聯(lián)合組=17.875，P<0.001;MMP-2：miR-381-mimics=6.521，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=12.259，P<0.001；q聯(lián)合組=20.605，P<0.001;MMP-9：miR-381-mimics=9.141，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=10.911，P<0.001；q聯(lián)合組=18.578，P<0.001)，E-cadherin的表達明顯增加(miR-381-mimics=5.240，P=0.002；qTMEM16A-siRNA=7.569，P<0.001；q聯(lián)合組=8.927，P<0.001)。

表5 各組細胞中caspase-3、caspase-9相對表達量的比較

圖4 miR-381靶向TMEM16A對AGS細胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9表達的影響

表6 各組細胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9相對表達量的比較

3 討論

miR-381定位于染色體14q32.31位點，該位點還包含有多種腫瘤抑制靶點miR-154、miR-377等。Tang et al[9]研究指出，miR-381在膠質(zhì)瘤中表達增加，可促進腫瘤的惡性進展。而Xia et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-381可通過下調(diào)YY1抑制上皮性卵巢癌。上述研究表明，miR-381在不同的腫瘤類型中發(fā)揮著抗癌或促癌作用，因此，針對miR-381的腫瘤治療必須考慮其雙重調(diào)控功能。本研究結(jié)果顯示，miR-381在胃癌組織和細胞系中呈低表達，與王麗 等[11]研究結(jié)果一致。miRNA的調(diào)控機制是非常復(fù)雜的，可參與DNA拷貝數(shù)變化、DNA甲基化、組蛋白修飾等過程，而且調(diào)控可發(fā)生于多個水平，如轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄時及轉(zhuǎn)錄后。

TMEM16A是一種潛在的致癌基因，可調(diào)節(jié)胞內(nèi)氯離子濃度激活MAPK信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Liu et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，過表達TMEM16A可能通過TGF-β信號通路促進胃癌細胞的增殖和侵襲，提示TMEM16A與胃癌細胞的生物學行為密切相關(guān)。本研究通過在線生物信息學預(yù)測軟件和雙熒光素酶實驗證實miR-381和TMEM16A的靶向關(guān)系，同時過表達miR-381的AGS細胞中TMEM16A mRNA表達下降，進一步驗證miR-381可負向調(diào)控TMEM16A的表達。

本研究顯示， miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌細胞AGS的增殖和侵襲，并促進其凋亡。P27蛋白是細胞周期素依賴激酶抑制劑，可抑制細胞由G1期進入S期[13]，因此，P27低表達可以加速細胞周期的進程，促進細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，miR-381可靶向TMEM16A促進P27的表達，提示miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌細胞AGS的增殖，可能與上調(diào)P27的表達有關(guān)。Caspase家族與真核細胞凋亡密切相關(guān)，Caspase-9是凋亡的觸發(fā)劑，而Caspase-3是凋亡的直接執(zhí)行者[14]。本研究顯示，miR-381可靶向TMEM16A促進Caspase-3、Caspase-9的表達，揭示miR-381可靶向TMEM16A促進胃癌細胞AGS的凋亡，可能與上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達有關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和遷移過程的重要生物學機制，E-cadherin是腫瘤浸潤抑制基因，可增強細胞簡單黏附作用，維持細胞骨架的穩(wěn)定，阻礙腫瘤細胞的侵襲；Vimentin是間質(zhì)細胞中的纖維蛋白，可用于評估上皮性腫瘤有無轉(zhuǎn)移；MMP家族可有效分解基底膜和細胞外基質(zhì)的主要成分，促進腫瘤細胞對鄰近組織的侵襲[15]。本研究顯示，miR-381可靶向TMEM16A促進E-cadherin的表達，抑制Vimentin、MMP-2及MMP-9 的表達，提示miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌細胞AGS的侵襲，可能與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的表達有關(guān)。

總之，本研究顯示miR-381在胃癌中低表達，并靶向TMEM16A抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，促進其凋亡，可能與調(diào)控P27、Caspase-3、Caspase-9、E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的表達有關(guān)。后續(xù)將選用動物模型，深入探究miR-381靶向TMEM16A對胃癌的影響。