羅 欣，周 宏， 顧亞男，李名聰，李昱昊，張勝權(quán)

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18是促炎癥因子，位于人類基因11號染色體，一個(gè)24 ku的前體，被caspase1切割成18 ku[1]。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞均能表達(dá)IL-18。 18 ku的IL-18通過與靶細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合激活相應(yīng)的信號途徑而發(fā)揮作用[2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要原因[3]。一般認(rèn)為脂質(zhì)代謝障礙是AS的始動因素，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，最近的研究[4]表明，多種炎癥因子在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，此外也發(fā)現(xiàn)AS斑塊中IL-18的表達(dá)水平較高，并且IL-18結(jié)合蛋白(interleukin 18 binding protein，IL-18BP)能夠降低AS斑塊形成風(fēng)險(xiǎn)[5-6]，提示IL-18在動脈硬化發(fā)病中可能發(fā)揮作用[6]。該研究通過探討IL-18對血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)炎癥因子的表達(dá)影響，以期初步闡明IL-18在AS中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑由生化教研室陳兵老師惠贈的小鼠VSMC，轉(zhuǎn)染了SV40大T抗原(SV40 large T antigen)后永生化的VSMC細(xì)胞株，10只8周齡SPF級C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，雌雄不限。小鼠VSMC由該實(shí)驗(yàn)室保存。鼠IL-18購自美國PeproTech.公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；pp38、pAKT(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)抗體購自美國Cell signaling公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑和RT-PCR試劑均購自日本TAKARA公司；ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；SB203580和LY294002購自美國Sigma公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 引物登陸NCBI網(wǎng)站檢索甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、 IL-8基因序列(人，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中復(fù)蘇鼠VSMC,用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素 (100 mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長到70%～80%時(shí)，以4×104/ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在實(shí)驗(yàn)前一天換無血清培養(yǎng)液。

1.3.2Real-time PCR檢測TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表達(dá) 在含有VSMC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入不同濃度的IL-18(3、10、30、100 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入TRIzol裂解細(xì)胞并提取總RNA；在另一塊含有VSMC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別于不同時(shí)間(2、6、12、18、24 h)加入IL-18(30 ng/ml)，最后加入TRIzol裂解細(xì)胞并提取總RNA，收取的樣本按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，Real-time PCR擴(kuò)增分析目的基因表達(dá)。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl，ROX DYEⅡ0.4 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl，總體積20 μl。在AB7500熒光定量分析儀上按程序運(yùn)行，以GAPDH為內(nèi)參。最后用相對定量分析法分析實(shí)驗(yàn)組與對照組。

1.3.3ELISA法分析TNF-α、IL-6、IL-8 蛋白水平表達(dá) 在含有VSMC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入IL-18(30 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書的方法分析VSMC上清液中的IL-6、 IL-8、 TNF-α蛋白的表達(dá)情況。

1.3.4Western blot分析IL-18的信號通路 在培養(yǎng)有VSMC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別采取不同時(shí)間(10、30、60、120 min)加入IL-18(30 ng/ml)，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取24孔板上總蛋白；在另一塊培養(yǎng)有VSMC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入SB203580 (10 μmol/L，p38MAPK抑制劑)和LY294002(50 μmol/L, PI3K抑制劑)，1h后再加入IL-18(30 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。收集的蛋白用12%SDS-丙烯酰胺凝膠為分離膠，10 μg蛋白上樣，濃縮膠中60 V電泳，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入分離膠后，100 V繼續(xù)電泳；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上(恒流200 mA，3 h)。5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，敷一抗4 ℃過夜，敷二抗2 h，用ECL發(fā)光劑壓膠片發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 IL-18對VSMC細(xì)胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表達(dá)的影響Real-time PCR檢測的結(jié)果顯示IL-18能促使VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表達(dá)量增加，并且與IL-18的濃度成正相關(guān)，與對照組(0 ng/ml)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)=48.372)；IL-18(30 ng/ml)能夠促使VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表達(dá)增加，且24 h內(nèi)表達(dá)量與時(shí)間成正相關(guān)，與對照組(0 h)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)=71.678)。即TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表達(dá)量與IL-18具有劑量和時(shí)間依賴性，見圖1。

圖1 Real-time PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)

2.2 IL-18對VSMC細(xì)胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平表達(dá)的影響ELISA法的結(jié)果分析顯示IL-18能夠顯著增加VSMC上清液中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平的表達(dá)，且與對照組(0 ng/ml)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)TNF-α=74.008，F(xiàn)IL-6=274.065，F(xiàn)IL-8=168.253)，見圖2。

2.3 IL-18對VSMC細(xì)胞中p38MAPK及PI3K/AKT信號通路的影響Western blot的結(jié)果分析顯示IL-18能夠增加VSMC細(xì)胞中pp38MAPK及pAKT的水平，其峰值分別在60 min及120 min(圖3A)。

圖2 IL-18增加VSMC細(xì)胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平表達(dá)

圖3 Western blot分析pp38MAPK及pAKT水平

2.4 IL-18刺激VSMC后TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白的表達(dá)水平與p38MAPK及AKT信號通路相關(guān)性為了進(jìn)一步探討IL-18增加TNF-α、IL-6、 IL-8的表達(dá)是否與p38MAPK及PI3K/AKT信號途徑激活激活相關(guān)，特異性抑制劑SB203580及LY294002處理VSMC細(xì)胞并分析其對IL-18誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。圖3B、C結(jié)果顯示，SB203580及LY294002分別特異性部分阻斷IL-18激活的p38MAPK及PI3K/AKT信號途徑。特異性抑制劑SB203580能部分阻斷IL-18誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)TNF-α=104.418，F(xiàn)IL-6=62.113，F(xiàn)IL-8=126.524)；特異性抑制劑LY294002能部分阻斷IL-18誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)TNF-α=94.658，F(xiàn)IL-6=75.382，F(xiàn)IL-8=56.970),見圖4。

圖4 SB203580及LY294002分別特異性阻斷IL-18誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、 IL-8表達(dá)

3 討論

AS是心腦血管疾病的主要原因。多年來的研究[7-8]表明，高膽固醇及高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)是AS原因之一。目前認(rèn)為動脈硬化的發(fā)病過程：過多的脂質(zhì)成分沉積在主動脈內(nèi)膜，氧化或糖化的LDL誘導(dǎo)血管壁細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞局部聚集，尤其是巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝入氧化的LDL形成泡沫細(xì)胞進(jìn)而形成脂質(zhì)條紋，進(jìn)一步的脂質(zhì)沉積和免疫細(xì)胞浸潤形成AS斑塊(包括脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)[4]。研究證明天然和獲得性免疫在AS的發(fā)生發(fā)展中都起作用。一系列細(xì)胞因子參與了其發(fā)展過程。天然免疫和炎癥小體活化，尤其是NOD樣受體家族3(NLRP3)和IL-1β在AS早期發(fā)展中發(fā)揮重要作用， 膽固醇在動脈硬化斑塊沉積活化NLRP3， 然后誘導(dǎo)IL-1β和IL-18釋放[9]。IL-18和IL-18Rα在硬化斑塊的細(xì)胞中高表達(dá)。研究[ 10-12]發(fā)現(xiàn) IL-18能夠進(jìn)一步刺激其他細(xì)胞釋放炎癥因子，包括IFNγ、IL-6等，而IL-18BP 能夠阻止動脈硬化斑塊的形成。本研究顯示，IL-18體外誘導(dǎo)VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的表達(dá)，提示AS斑塊中的細(xì)胞因子不僅僅來自免疫細(xì)胞，VSMC也表達(dá)炎癥因子。此外，這些炎癥因子還調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而參與了AS斑塊的發(fā)生發(fā)展[13]。這一結(jié)果說明了IL-18可以通過影響VSMC表達(dá)炎癥因子產(chǎn)生的次級效應(yīng)而發(fā)揮作用，同時(shí)通過阻斷IL-18可能成為防治AS的新途徑。

進(jìn)一步的機(jī)制研究表明IL-18能夠激活VSMC中p38和PI3K/AKT信號通路，提示IL-18參與了AS中炎癥因子激活的信號途徑網(wǎng)絡(luò)并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞的信號通路有很多，調(diào)控及相互作用極其復(fù)雜。研究[14]發(fā)現(xiàn)IL-18能夠激活p38、 ERK1/2 MAPKs、 STAT3 和 NF-κB 等信號途徑。此外，研究[15]發(fā)現(xiàn)用IL-18處理小鼠皮層神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)：IL-18通過增強(qiáng)PI3K和磷酸化AKT的水平，激活了PI3K/AKT通路,并進(jìn)而激活其下游的NF-κ B。本研究顯示IL-18激活VSMC細(xì)胞的P38和AKT信號通路通路，并進(jìn)而分析其對炎癥因子表達(dá)的影響。但是，IL-18對VSMC的調(diào)控可能還涉及到其他信號通路及調(diào)控其他細(xì)胞因子的表達(dá)、以及對細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，這些問題均有待進(jìn)一步研究。

綜上， IL-18體外增加VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8 3種炎癥因子表達(dá)，其機(jī)制部分依賴p38和PI3K/AKT信號通路的活化。該結(jié)果可能有助于闡明IL-18在AS發(fā)生發(fā)展中的部分作用機(jī)制，為尋找AS新的防治措施奠定基礎(chǔ)。