安曉麗， 徐亞男， 劉懿萱， 金美玉， 崔錫花， 廉美蘭*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 龍井 133400)

東革阿里(EurycomalongifoliaJack)又稱東革亞里、馬來(lái)參和鄉(xiāng)土人參等，為苦木科東革阿里屬，是一種野生灌木植物[1]。東革阿里多生長(zhǎng)于海灘森林及海拔700 m以下的原生或次生林[2]，主要分布于越南、印度尼西亞和馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家。東革阿里全株均可入藥，多以根部為主，可單獨(dú)用藥，也可與其他藥材搭配使用[3]，馬來(lái)西亞及其它土著人將東革阿里作為退熱藥、養(yǎng)顏藥、壯陽(yáng)藥和中毒以及蛇毒的解毒配方[4]。然而，因東革阿里的野生資源被肆意砍伐，使其生長(zhǎng)環(huán)境嚴(yán)重毀壞。東革阿里繁殖多采用有性繁殖方法，但其種子萌發(fā)率低且發(fā)芽緩慢，加上植株生長(zhǎng)遲緩，導(dǎo)致東革阿里現(xiàn)有資源不能滿足市場(chǎng)需求[5]。植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的快速增殖植物的培養(yǎng)技術(shù)[6-8]，其中，生物反應(yīng)器是獲取大量植物細(xì)胞、組織和器官的重要途徑[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，利用生物反應(yīng)器可在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量東革阿里不定根，但尚不明確培養(yǎng)的不定根中是否含有東革阿里的代表性物質(zhì)。

東革阿里含有苦木素二萜類、生物堿類及揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[10]，其中，苦木素二萜類化合物是最主要的活性成分?？嗄舅囟祁愔凶罹叽硇缘氖菍捓t酮[11-12]，這種物質(zhì)具有抗瘧、提升性功能、緩解勞累、除菌及抗癌等作用[13-17]。目前，寬纓酮含量測(cè)定方面的研究并不廣泛，國(guó)內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)有2篇論文闡述了利用HPLC測(cè)定寬纓酮含量的方法。如，陳秀明等[18]用Waters Sunfire C18(4.6×250 m,5 μm)色譜柱，以乙腈和0.1%甲酸為流動(dòng)相，在檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，柱溫40 ℃的條件下，測(cè)定了6種不同產(chǎn)地的東革阿里中寬纓酮含量。李紅亮等[19]用Agilent TC-C18柱(4.6×250 m,5 μm)，以乙腈和水為流動(dòng)相，流速1.0 mg/mL，柱溫40 ℃的條件下，測(cè)定了寬纓酮含量。這2種測(cè)定方法為該試驗(yàn)對(duì)東革阿里不定根中寬纓酮含量進(jìn)行測(cè)定提供了參考。

提取條件對(duì)植物有效物質(zhì)的提取率、含量及活性等方面有很大影響，因此，眾多學(xué)者通過(guò)完善植物的提取工藝來(lái)提升其有效物質(zhì)含量。袁會(huì)成和李天琴[20]采用單因素試驗(yàn)法篩選了提取紫花地丁多糖的最佳條件，并測(cè)定了多糖含量，優(yōu)化的提取工藝為：提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶30(g∶mL)及乙醇濃度90%，此時(shí)多糖提取率(6.27%)高于其他條件，而影響較大的提取條件為提取時(shí)間和提取次數(shù)。肖文敏等[21]探究了提取溫度、提取時(shí)間、提取溶劑及不同部位對(duì)苦菜中Vc含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦菜葉中Vc含量高于其他部位，為0.072 g/L；在30 ℃下用甲醇提取苦菜葉60 min，測(cè)得苦菜葉中Vc含量遠(yuǎn)高于用乙醇提取。因此，提取條件中影響較大的是提取溫度和提取時(shí)間。董安強(qiáng)等[22]采用超聲提取法探究了乙醇濃度、提取時(shí)間及料液比等對(duì)青錢柳葉中總黃酮含量的影響，篩選出的最佳提取工藝為：70%乙醇、提取40 min和料液比1∶80(g∶mL),此時(shí)測(cè)定的總黃酮提取率為2.95%，其中影響最大的是提取溶劑濃度，其次是提取時(shí)間。而目前尚未報(bào)道關(guān)于東革阿里不定根提取條件對(duì)寬纓酮含量的影響，因此，該試驗(yàn)對(duì)不定根的提取工藝(提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度和提取次數(shù))進(jìn)行了探究，為以后東革阿里不定根的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照Tao等[23]的試驗(yàn)方法培養(yǎng)東革阿里不定根。具體為：取不定根20 g(鮮重)，接種于含有4 L培養(yǎng)基的5 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基為3/4 MS+吲哚丁酸3 mg/L+蔗糖40 g/L，pH值5.8，通氣量75 mL/min，培養(yǎng)溫度25 ℃。暗培養(yǎng)30 d后收獲不定根，用自來(lái)水充分沖洗后，置于45 ℃遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，干燥的不定根作為該試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 東革阿里不定根寬纓酮含量的測(cè)定

1) 樣品制備 稱取1 g東革阿里不定根干品于燒瓶中，加入60%乙醇20 mL，在60 ℃下回流提取2 h，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，濾液合并后減壓濃縮得到樣品。將樣品用50%色譜甲醇溶解并定容到10 mL，濾膜過(guò)濾后用HPLC測(cè)定寬纓酮含量(圖1)。

圖1 對(duì)照品(A)和樣品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC of reference(A) and sample(B)

2) 寬纓酮測(cè)定方法 使用C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，Theromo Scientifice，美國(guó))和紫外可見檢測(cè)器(SPD-15C，島津公司，日本)。HPLC測(cè)定條件為：進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，流動(dòng)相為乙腈(B)和去離子水(A)，采用等度洗脫，程序?yàn)椋?～40 min，7% B。流速1 mL/min，柱溫25 ℃。寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度> 98.0%)購(gòu)于四川成都埃法生物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用50%色譜甲醇溶液溶解并稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。用濾膜過(guò)濾后，取20 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC的測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。之后，對(duì)HPLC測(cè)定的精密度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性進(jìn)行了分析。

①精密度分析：取10～20 μL寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5 mg/mL)進(jìn)樣，重復(fù)5次，記錄每次的出峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

②穩(wěn)定性分析：取10～20 μL寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5 mg/mL)進(jìn)樣，每隔2 h進(jìn)樣1次，重復(fù)5次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD值。

③重現(xiàn)性分析：取10～20 μL不定根樣品溶液進(jìn)樣，重復(fù)5次，記錄測(cè)定的峰面積，并計(jì)算RSD值。

1.2.2 東革阿里不定根中寬纓酮提取工藝的篩選

1) 提取溶劑濃度 稱取1 g東革阿里不定根材料，分別加入20 mL不同濃度的乙醇(0、30%、60%、90%)，在60 ℃下回流提取2 h，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，濾液合并后進(jìn)行減壓濃縮。

2) 提取時(shí)間 稱取1 g東革阿里不定根干品，加入20 mL 60%乙醇，于60 ℃下回流提取。將提取時(shí)間分別設(shè)定為1、2和3 h，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，濾液合并后進(jìn)行減壓濃縮。

3) 提取溫度 稱取1 g東革阿里不定根干品，加入20 mL 60%乙醇，分別于40、50、60和70 ℃下回流提取，提取時(shí)間為2 h。收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，濾液合并后進(jìn)行減壓濃縮。

4) 提取次數(shù) 稱取1 g東革阿里不定根材料，加入20 mL 60%乙醇，在50 ℃下回流2 h，收集濾液，提取次數(shù)分別設(shè)為1、2、3和4次，濾液合并后減壓濃縮。

5) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)表(表1)，測(cè)定不同提取條件對(duì)提取物中寬纓酮含量的影響。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34)

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)處理均設(shè)置3次重復(fù)，利用SPSS 11.5軟件，采用鄧肯式新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，然后利用Graphpad Prism 7軟件作圖并進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 纓酮HPLC的測(cè)定分析

取20 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，所得回歸方程為y=2E+07x+415 510，R2=0.994 5，寬纓酮在0.1～0.6 mg/mL時(shí)呈線性關(guān)系。

圖2 寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve line of eurycomanone

進(jìn)而對(duì)寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行5次HPLC測(cè)定，根據(jù)測(cè)定的峰面積計(jì)算得到的RSD值僅為0.43%(表2)，說(shuō)明HPLC儀器較為精密。

表2 精密度試驗(yàn)檢測(cè)Table 2 Experiment of accuracy

然后對(duì)寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行5次HPLC測(cè)定，每間隔2 h進(jìn)樣，根據(jù)測(cè)定的峰面積計(jì)算得到的RSD值低至0.11%(表3)，說(shuō)明HPLC儀器的檢測(cè)值較為穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)Table 3 Experiment of stability

對(duì)東革阿里不定根溶液進(jìn)行5次HPLC檢測(cè)，測(cè)定的不定根中寬纓酮含量平均為0.93 mg/g，根據(jù)測(cè)得的含量計(jì)算得到的RSD(0.36%)值較低，說(shuō)明不定根中寬纓酮的重現(xiàn)性良好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)檢測(cè)Table 4 Experiment of reproducibility

2.2 東革阿里不定根中寬纓酮提取工藝的篩選

2.2.1 提取溶劑濃度對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響

由圖3可知，當(dāng)提取溶劑濃度低于60%時(shí)，其寬纓酮含量隨之升高；提取溶劑濃度達(dá)到60%以上時(shí)，其寬纓酮含量隨濃度升高逐漸下降，因此，最佳提取溶劑濃度為60%，此時(shí)不定根中寬纓酮的含量最高，為0.90 mg/g。

圖3 提取溶劑濃度對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響Fig.3 Effect of extraction concentration on the content of eurycomanone from adventitious roots

2.2.2提取時(shí)間對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響

當(dāng)提取時(shí)間為1～2 h時(shí)，不定根中寬纓酮含量逐漸升高；為2～3 h時(shí)，寬纓酮含量降低，故最佳提取時(shí)間選擇2 h，此時(shí)不定根中寬纓酮含量達(dá)到最高，為1.28 mg/g(圖4)?？赡茈S著提取時(shí)間的增加，不定根中有效物質(zhì)逐漸滲出，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，有些物質(zhì)會(huì)被破壞，使其含量降低[24]。

圖4 提取時(shí)間對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the content of eurycomanone from adventitious roots

2.2.3 提取溫度對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響

由圖5可知，當(dāng)提取溫度低于50 ℃時(shí)，不定根中寬纓酮含量隨溫度升高呈上升趨勢(shì)；當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，寬纓酮的含量最高；提取溫度高于50 ℃，寬纓酮的含量隨溫度升高而降低。因此，過(guò)低或過(guò)高的溫度都不利于從東革阿里不定根中提取寬纓酮，故最佳提取溫度選擇50 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the content of eurycomanone from adventitious roots

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響

當(dāng)提取次數(shù)為1～2次時(shí)，不定根中寬纓酮的含量增加；提取次數(shù)達(dá)到2次以上，其寬纓酮含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此，提取次數(shù)為2次時(shí)，寬纓酮含量達(dá)到最高(圖6)。

圖6 提取次數(shù)對(duì)不定根中寬纓酮含量的影響Fig.6 Effect of extraction times on the content of eurycomanone from adventitious roots

2.2.5 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，利用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)提取溶劑濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和提取次數(shù)(D)組合，探究各組合提取物對(duì)寬纓酮含量的影響(表5)。

表5 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment and result

由表5可知，第4組中測(cè)得的寬纓酮含量高于其他組，其提取條件為提取溶劑濃度60%、提取時(shí)間1 h、提取溫度50 ℃、提取3次，該條件下提取物中寬纓酮含量高于其他組合，為1.71 mg/g。分析極差R后發(fā)現(xiàn)，極差由大到小依次為提取溶劑濃度(A)>提取次數(shù)(D)>提取溫度(C)>提取時(shí)間(A)，說(shuō)明4種因素對(duì)提取物中寬纓酮含量的影響程度不同，影響最大的是提取溶劑濃度。對(duì)平均值K值進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，提取溶劑濃度(A)中K2最大，提取時(shí)間(B)中K1值最大，提取溫度(C)和提取次數(shù)(D)中K3值最大，此提取條件為A2B1C3D3，即提取溶劑濃度60%、提取時(shí)間1 h、提取溫度60 ℃、提取3次。

對(duì)正交試驗(yàn)中A2B1C3D3組合進(jìn)行驗(yàn)證，并與第4組A2B1C2D3的測(cè)定結(jié)果對(duì)比分析，結(jié)果表明，在A2B1C3D3條件下提取的東革阿里不定根提取物中寬纓酮含量為1.74 mg/g，略高于第4組中的測(cè)定值，故該試驗(yàn)最佳提取條件為A2B1C3D3，且該提取條件較為穩(wěn)定(表6)。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Verification of test results

3 討論

植物中活性物質(zhì)的提取效果受很多因素的影響，如提取時(shí)間、提取溫度、提取溶劑濃度和提取次數(shù)等。研究表明，提取時(shí)間過(guò)短會(huì)使活性物質(zhì)難以全部提出，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使植物中雜質(zhì)大量析出，導(dǎo)致活性物質(zhì)提取效果較差；提取溫度過(guò)低使活性物質(zhì)溶出率低，而溫度較高會(huì)導(dǎo)致提取溶劑揮發(fā)，使較多雜質(zhì)溶出，會(huì)破壞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成物質(zhì)含量降低；提取溶劑濃度過(guò)高會(huì)增加物質(zhì)與溶劑極性差距，使物質(zhì)溶解度下降[24]；提取次數(shù)太少會(huì)使活性物質(zhì)無(wú)法充分溶出，而提取次數(shù)太多會(huì)浪費(fèi)藥品。目前，對(duì)東革阿里不定根的研究多是關(guān)于完善其生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件方面的，尚無(wú)以寬纓酮含量為測(cè)定指標(biāo)研究不定根提取條件方面的報(bào)道。

東革阿里中最具代表性的物質(zhì)是寬纓酮，而國(guó)內(nèi)僅有1篇論文涉及到了東革阿里提取條件的相關(guān)研究及寬纓酮含量的測(cè)定。李紅亮等[19]比較分析了不同提取溶劑濃度對(duì)東革阿里中寬纓酮含量的影響，發(fā)現(xiàn)最佳溶劑濃度為60%，此時(shí)寬纓酮的色譜峰面積達(dá)到最大，這與該試驗(yàn)結(jié)果相符；比較不同提取次數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)3次為最佳提取次數(shù)，這與該試驗(yàn)結(jié)果相似；在篩選提取時(shí)間的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取東革阿里3 h時(shí)，其根中積累的寬纓酮含量最高，而該試驗(yàn)中寬纓酮含量達(dá)到最高時(shí)的提取時(shí)間為1 h，考慮到研究材料及測(cè)定儀器等不同所篩出的提取條件也會(huì)存在差異。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定了東革阿里不定根中寬纓酮含量，結(jié)果表明，HPLC儀器的檢測(cè)具有良好的精密度和穩(wěn)定性，而且不定根中寬纓酮的重現(xiàn)性較好，說(shuō)明此測(cè)定方法及條件適用于東革阿里不定根中寬纓酮含量的測(cè)定。該試驗(yàn)篩選出的促進(jìn)東革阿里不定根中寬纓酮積累的最優(yōu)提取工藝為：提取溶劑濃度60%，提取時(shí)間1 h，提取溫度60 ℃，提取3次，此時(shí)不定根中寬纓酮含量達(dá)到最大值，為1.74 mg/g。