盛煜鈞， 陳 宇， 元慶浩， 梁相鎭， 曹后男*， 宗成文

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.韓國(guó)農(nóng)業(yè)振興廳園藝特作研究院,韓國(guó) 羅州 520-010)

藍(lán)靛果(LoniceraedulisTurcz.)又名山茄子、羊奶子、黑瞎子果等[1]，是忍冬科、忍冬屬多年生落葉小灌木。藍(lán)靛果是一種可食用的野生漿果類植物，果實(shí)成熟期在6～7月中旬[2]，屬中生植物，喜濕，抗寒性和抗霜能力極高，可忍受-50 ℃以下低溫[3]。藍(lán)靛果野生資源主要分布在日本、俄羅斯、朝鮮、中國(guó)、北美等國(guó)家[4]，在我國(guó)主要分布在華北、西北、東北、西南和內(nèi)蒙等地區(qū)，汪清及和龍等地區(qū)是延邊藍(lán)靛果的主產(chǎn)區(qū)。藍(lán)靛果中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含10%～17%的干物質(zhì)[4]，此外，還富含多酚、黃酮、花色苷、花青甙、蕓香甙、兒茶酸等[5]對(duì)人類健康有益的活性物質(zhì)，具有較高的食用價(jià)值。

自然環(huán)境下生長(zhǎng)的許多重要作物多是二倍體，育種學(xué)家自30年代開始就熱衷于多倍體誘導(dǎo)育種的研究，隨著對(duì)多倍體產(chǎn)生途徑、特征特性及鑒定方法等方面更為深入的研究，多倍體誘導(dǎo)育種在育種領(lǐng)域顯示出日益廣闊的發(fā)展前景[6]。關(guān)于藍(lán)靛果的倍性研究，俄羅斯學(xué)者Plekhanova[7]及國(guó)內(nèi)學(xué)者霍俊偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，俄羅斯野生藍(lán)靛果中既有二倍體又有四倍體。長(zhǎng)白山地區(qū)的野生藍(lán)靛果果實(shí)單果重小，果味酸甜微澀，帶有輕微苦味[9]。多倍體植株的表型特征是莖粗、葉大、花大、果實(shí)大，果實(shí)巨大性是多倍體最為顯著的外部形態(tài)特征，相對(duì)應(yīng)植株所含糖類和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量都有所增加，因此，選育多倍體藍(lán)靛果對(duì)改善野生藍(lán)靛果品質(zhì)具有重要意義。該試驗(yàn)以二倍體、四倍體、八倍體藍(lán)靛果組培苗及大田苗為試材，測(cè)定分析了藍(lán)靛果植物學(xué)性狀差異、葉片的生理活性成分含量差異及細(xì)胞學(xué)差異，為早期選擇符合多倍體特征的藍(lán)靛果植株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

二倍體藍(lán)靛果(從長(zhǎng)白山野生藍(lán)靛果中篩選出的果大，豐產(chǎn)，無(wú)澀味，口感較甜的優(yōu)良單株)及其人工誘導(dǎo)的四倍體和八倍體組培苗及1年生大田苗。

1.2 方法

1.2.1 植物學(xué)性狀觀察

選擇培養(yǎng)45 d的不同倍性藍(lán)靛果組培苗及其在田間生長(zhǎng)1年的植株，用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)的測(cè)量其株高、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)、葉厚、葉長(zhǎng)、葉寬。

1.2.2 葉片細(xì)胞學(xué)觀察

采摘藍(lán)靛果頂端第2、3層葉片，將其放入卡諾固定液中浸泡至葉片全部褪去綠色為止，立即用1N HCL解離4 min，具體可根據(jù)葉片老嫩程度，后用蒸餾水洗4 min，將葉片用1% I-KI染色液染色40 s，制作臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡下觀察氣孔形態(tài)及葉綠體，每個(gè)樣品制作3個(gè)臨時(shí)裝片，每個(gè)裝片觀察10個(gè)視野并拍照，測(cè)量氣孔長(zhǎng)和寬，記錄視野中氣孔數(shù)目、葉綠體數(shù)目。

1.2.3 葉片花青素、類黃酮及總酚測(cè)定方法

按照楊玲等[10]的測(cè)定方法，花青素在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，類黃酮在325 nm處測(cè)定，總酚在280 nm處測(cè)定，含量以mg/g表示。

1.2.4 葉片維生素C含量的測(cè)定

按照賈洪斌等[11]的測(cè)定方法，根據(jù)公式計(jì)算藍(lán)靛果葉片中VC含量。

式中,C為測(cè)定液中維生素C含量/mg;Vt為提取液總體積/mL;Vm為測(cè)定液體積/mL;W為樣品重/g。

1.2.5 葉綠素含量的測(cè)定

采用盛璐等[12]的測(cè)定方法，按照以下公式計(jì)算藍(lán)靛果葉片中葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)和總?cè)~綠素含量(C總)。

C總=Ca+Cb

式中,A663為663 nm測(cè)定的吸光值;A645為645 nm測(cè)定的吸光值;V為測(cè)定液體積/mL;W為樣品重/g。

1.2.6 葉片氮素及葉色值的測(cè)定

采用植株養(yǎng)分速測(cè)儀(TYS-3N)測(cè)定藍(lán)靛果葉片中氮素含量及葉色值，選擇正常生長(zhǎng)且沒有蟲食的健康葉片進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)葉片取不同位置進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)20次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同倍性藍(lán)靛果植物學(xué)性狀調(diào)查

不同倍性藍(lán)靛果組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示。

圖1 不同倍性藍(lán)靛果組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 Growth status of invitro cultured plantlets of Lonicera edulis different ploidy

由表1可知，二倍體和四倍體的株高無(wú)顯著差異，八倍體株高顯著低于二倍體和四倍體；二倍體和四倍體組培苗表現(xiàn)為莖細(xì)、節(jié)間長(zhǎng)，而八倍體組培苗則表現(xiàn)為莖粗且節(jié)間短，莖粗和節(jié)間長(zhǎng)與二倍體和四倍體組培苗存在顯著差異；二倍體和四倍體的葉片長(zhǎng)度顯著高于八倍體，葉寬與葉形指數(shù)沒有顯著差異(表1)，變幅表示所測(cè)樣本的范圍即樣本中最大值與最小值。

表1 不同倍性藍(lán)靛果組培苗植物學(xué)性狀調(diào)查Table 1 Botanical characters of invitro cultured plantlets of Lonicera edulis different ploidy

不同倍性藍(lán)靛果大田苗生長(zhǎng)狀態(tài)如圖2所示。

圖2 不同倍性藍(lán)靛果大田苗的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 Growth status of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy

由表2可知，不同倍性大田苗株高存在顯著差異，倍性增加，株高越??；二倍體莖粗和四倍體有差異但不顯著，二倍體與八倍體差異顯著；八倍體節(jié)間長(zhǎng)與二倍體和四倍體存在顯著差異，四倍體與二倍體之間無(wú)顯著差異；不同倍性大田苗葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異，葉寬存在顯著差異，倍性增加，葉片越寬，葉形指數(shù)沒有顯著差異。

表2 不同倍性藍(lán)靛果大田苗植物學(xué)性狀調(diào)查Table 2 Botanical characters of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy

2.2 不同倍性藍(lán)靛果葉片氣孔數(shù)量、大小、密度及葉綠體數(shù)目

細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果如表3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同倍性組培苗氣孔長(zhǎng)度存在顯著差異，倍性增加，氣孔長(zhǎng)度越大；在大田苗中二倍體與八倍體存在顯著差異，四倍體與八倍體差異顯著，四倍體與二倍體有差異但不顯著。八倍體葉片中氣孔寬度與四倍體、二倍體存在顯著差異，二倍體和四倍體之間差異不顯著，組培苗和大田苗趨勢(shì)一致。不同倍性組培苗藍(lán)靛果葉片氣孔中的葉綠體數(shù)存在顯著差異(圖3)，倍性增加，氣孔中的葉綠體數(shù)越多，組培苗和大田苗中趨勢(shì)一致。不同倍性大田苗氣孔密度存在顯著差異(圖4)，倍性增加，相同面積下的氣孔數(shù)越少，即氣孔密度越小。

表3 不同倍性藍(lán)靛果葉片氣孔大小、密度及葉綠體數(shù)目Table 3 Stomata size, stomata density and number of chloroplasts in leaves of Lonicera edulis different ploidy

圖3 不同倍性藍(lán)靛果組培苗氣孔葉綠體數(shù)目Fig.3 Chloroplast numbers of in vitro cultured plantles of Lonicera edulis different ploidy

圖4 不同倍性藍(lán)靛果大田苗葉片氣孔密度觀察(10×40)Fig.4 Leaf stomatal density of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy(10×40)

2.3 不同倍性藍(lán)靛果葉片生理活性成分含量

不同倍性藍(lán)靛果葉片生理活性成分含量如表4所示。葉片中花青素、類黃酮及總酚含量存在顯著差異，八倍體葉片中的含量顯著高于二倍體和四倍體，四倍體顯著高于二倍體。倍性增加，花青素、類黃酮和總酚的含量越高，大田苗與組培苗趨勢(shì)一致；而維生素C的含量是隨著倍性增加，逐漸降低，二倍體和八倍體之間存在顯著差異，二倍體和四倍體之間差異不顯著。

表4 不同倍性藍(lán)靛果葉片生理活性成分含量Table 4 Content of physiological active components in leaves of Lonicera edulis different ploidy (mg/g)

2.4 不同倍性藍(lán)靛果葉片葉綠素含量

藍(lán)靛果葉片葉綠素含量測(cè)定結(jié)果如表5所示。八倍體葉綠素a含量、葉綠素b含量與二倍體之間存在顯著差異，四倍體和二倍體差異不顯著但數(shù)值介于二倍體和八倍體之間，隨著倍性增加，葉片中葉綠素含量越高。不同倍性總?cè)~綠素含量存在顯著差異，八倍體顯著高于四倍體和二倍體，四倍體顯著高于二倍體。葉綠素a和葉綠素b比值二倍體和八倍體之間存在顯著差異，四倍體與二倍體存在差異但差異不顯著。

2.5 不同倍性藍(lán)靛果葉色值及氮素值

不同倍性藍(lán)靛果葉片中葉色值存在顯著差異，倍性增加，葉色值越大，綠色越濃郁。二倍體和八倍體之間氮素含量差異顯著，四倍體與二倍體和八倍體差異不顯著，但介于二者之間，藍(lán)靛果葉片氮素含量與倍性存在一定的正相關(guān)關(guān)系。大田苗與組培苗趨勢(shì)一致(表6)。

表6 不同倍性藍(lán)靛果葉色值及氮素值Table 6 Leaf color value and nitrogen value of Lonicera edulis different ploidy

3 討論

大量研究結(jié)果表明，多倍體植株在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一般呈現(xiàn)出巨大性，即植株體中細(xì)胞、組織和器官通常比其二倍體親本更大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨著倍性增加而增加[13]。王同坤等[14]的研究表明，四倍體玫瑰香不僅保持了二倍體玫瑰香品種原有的色、香、味優(yōu)點(diǎn)，還較其提前成熟7～10 d，果粒增大，生長(zhǎng)勢(shì)、豐產(chǎn)性增強(qiáng)，抗病力略有增加。而長(zhǎng)白山地區(qū)的野生藍(lán)靛果果實(shí)單果重小，果味酸甜微澀，帶有輕微苦味，因此，選育多倍體藍(lán)靛果對(duì)改善野生藍(lán)靛果品質(zhì)具有重要意義。

程曉紊等[15]利用細(xì)胞學(xué)法對(duì)三倍體甜葉菊進(jìn)行倍性鑒定的結(jié)果表明，在多倍體育種中，根據(jù)氣孔大小來(lái)鑒定倍性是一種常用的辦法，氣孔的變化可以作為鑒定多倍體的一個(gè)重要指標(biāo)。該試驗(yàn)中葉片氣孔特征表明，與二倍體相比八倍體的氣孔及其氣孔密度變小，體積變大，保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)量增多。不同倍性藍(lán)靛果大田苗植物學(xué)形狀差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，外部形態(tài)特征和葉片下表皮氣孔密度變小等氣孔特征可作為鑒定變異材料的間接方法。

多倍體特征除了細(xì)胞學(xué)差異外，該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同倍性藍(lán)靛果葉片中生理活性成分含量存在顯著差異，藍(lán)靛果葉片中花青素、類黃酮和總酚含量與倍性呈正相關(guān)關(guān)系，倍性越大，含量越高，而VC含量隨著倍性升高而減少。李建勛[16]的試驗(yàn)結(jié)果表明，四倍體黑果腺肋花楸葉片中花青素、總酚和總黃酮含量微高于二倍體。姚宇[17]的研究表明，黑果枸杞葉片中花青素含量隨著倍性增加而增加，抗壞血酸隨著倍性增加而減少。與該試驗(yàn)在藍(lán)靛果中得到的結(jié)果一致。鄭鋒等[18]的試驗(yàn)結(jié)果表明，小型西瓜鮮果中VC含量倍性越高含量越高，但大多差異不顯著。謝國(guó)芳等[19]對(duì)金刺梨果實(shí)和葉片中VC含量測(cè)定顯示，果實(shí)中VC含量顯著高于葉片。相較于葉片測(cè)定而言，果實(shí)中VC含量會(huì)更具有典型性，由于沒有果實(shí)的材料無(wú)法進(jìn)行驗(yàn)證，果實(shí)中VC含量需要更進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)加入植株養(yǎng)分速測(cè)儀用以測(cè)定葉片葉色值和氮素含量，在不損傷葉片的基礎(chǔ)上，對(duì)葉片的葉綠素、含氮量進(jìn)行測(cè)定，得到結(jié)果是倍性越高，葉色值和含氮量越高。因此，在做多倍體研究時(shí)也可以根據(jù)生理活性成分含量進(jìn)行早期檢測(cè)，為后期鑒定提供依據(jù)。

4 結(jié)論

組培苗植物學(xué)性狀調(diào)查結(jié)果表明，二倍體和四倍體組培苗表現(xiàn)為株高、莖細(xì)、節(jié)間長(zhǎng)、葉薄、葉長(zhǎng)，而八倍體組培苗則表現(xiàn)為植株矮、莖粗、節(jié)間短、葉厚、葉短，八倍體的莖粗和節(jié)間長(zhǎng)與二倍體和四倍體組培苗存在顯著差異。大田苗植物學(xué)性狀調(diào)查結(jié)果表明倍性增加，株高越小、莖越粗、節(jié)間越短、葉片越厚、葉片越寬。不同倍性藍(lán)靛果葉片氣孔密度、氣孔中葉綠體數(shù)存在顯著差異，倍性越大，氣孔越大，氣孔密度越低，氣孔內(nèi)葉綠體數(shù)量越多，組培苗和大田苗變化趨勢(shì)一致。生理活性成分含量測(cè)定結(jié)果表明，不同倍性藍(lán)靛果葉片中花青素、類黃酮及總酚含量存在顯著差異，倍性越大，含量越高；VC含量變化趨勢(shì)則相反，倍性增加，含量減少，二倍體與八倍體植株存在顯著差異。不同倍性藍(lán)靛果葉片總?cè)~綠素含量存在顯著差異，倍性增加，葉色值越大，氮素含量越高，大田苗與組培苗趨勢(shì)一致。