張 平，袁曉慧，黃華坤，楊春梅，張露露，羅小輯，羅進(jìn)勇*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 臨床診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科， 重慶 400016)

骨組織工程主要以種子細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、支架材料3者構(gòu)建細(xì)胞生物材料復(fù)合體，是治療由外傷、感染、腫瘤等因素導(dǎo)致骨缺損的理想手段[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類多能祖細(xì)胞，來源于骨髓、臍帶、滑膜等，可多向分化為骨及軟骨、脂肪、肌肉等組織，是骨組織工程中重要的種子細(xì)胞[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)則是骨再生中誘導(dǎo)成骨分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，現(xiàn)已知包含15個(gè)成員，但僅BMP-2、4、6、7、9能誘導(dǎo)軟骨及骨形成。其中重組人BMP2及BMP7已作為骨誘導(dǎo)劑應(yīng)用于臨床治療骨不連及骨缺損[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BMP9在體內(nèi)外促成骨能力最強(qiáng)，但機(jī)制尚不明確[4]。矮小身材同源框基因(short stature homeobox 2,Shox2)是同源框家族一員，編碼含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的60個(gè)氨基酸殘基基序蛋白質(zhì)。在骨發(fā)育中，Shox2突變小鼠模型表現(xiàn)出肱骨股骨缺失導(dǎo)致的肢體縮短，且與軟骨形成密切相關(guān)[5]，而SHOX2在成骨形成中的作用研究較少。此外，鼠科SHOX2蛋白與人同源性高達(dá)99%[6]。因此，本文通過體外實(shí)驗(yàn)在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2細(xì)胞中過表達(dá)SHOX2，來探討其對BMP9誘導(dǎo)的成骨分化影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2(美國典型菌種保藏中心， ATCC)；人胚腎HEK293和結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系(本實(shí)驗(yàn)室保存)；高保真酶PrimeSTAR、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)定量底物(TaKaRa公司)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XbaⅠ、PmeⅠ、PacⅠ，DNA連接酶(New England BioLabs公司)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega Bio-tek公司)；LipofectamineTm2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientificals公司)；BMP9過表達(dá)腺病毒(BMP9 recombinant adeno-viruse, Ad-BMP9，芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室何通川教授惠贈(zèng))；結(jié)晶紫染液、蛋白提取試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；細(xì)胞裂解液(Promega公司)；抗壞血酸(Sangon Biotech公司)；β-甘油磷酸二鈉鹽和茜素紅S(Solarbio公司)；PCR引物(GeneScript公司合成)；DMEM高糖培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司)；兔抗人成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2, RUNX2)(Abcom公司)；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、兔抗T-EKR1/2、兔抗人p-EKR1/2(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人β-actin(南京鐘鼎生物公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠 IgG(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理： 實(shí)驗(yàn)分為對照(normal control, NC)組，SHOX2過表達(dá)腺病毒(SHOX2 recombinant adenoviruse, Ad-SHOX2)組，BMP9組和BMP9+Ad-SHOX2組。將C3H10T1/2 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%恒溫培養(yǎng)箱。NC組不做處理。待細(xì)胞匯合度約40%，BMP9+Ad-SHOX2組加入Ad-SHOX2，8 h后換液，24 h后加入條件培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)。Ad-SHOX2組及BMP9組于同上時(shí)間點(diǎn)作相應(yīng)處理。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)： 引物設(shè)計(jì)(表1)，SHOX2 NCBI參考序列為NM_013665.1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.3 Ad-SHOX2的構(gòu)建： 穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-SHOX2和重組質(zhì)粒構(gòu)建以及腺病毒包裝，參照文獻(xiàn)[7]的方法。LipofectamineTm2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，表達(dá)紅色熒光且熒光量增加則構(gòu)建成功。

1.2.4 BMP9條件培養(yǎng)液的制備： 將HCT116細(xì)胞接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞增殖至匯合度約80%，加入Ad-BMP9，4 h后換液為5 mL雙無抗培養(yǎng)液，分別于24 與48 h收取條件培養(yǎng)液，1 000 r/min離心3 min去除細(xì)胞及碎片。

1.2.5 ALP活性的測定： 將C3H10T1/2細(xì)胞接種于 24 孔板條件培養(yǎng)5 d，ALP定性按照ALP染色試劑盒參考方法進(jìn)行檢測。ALP定量測定，每孔加入100 μL 1×細(xì)胞裂解液，靜置5 min，收集裂解液于1.5 mL 離心管，13 000 r/min，離心5 min，吸取10 μL上清液于工作液(5 μL ALP底物+10 μL緩沖液)，測定熒光值。

1.2.6 鈣鹽沉積的測定： 將C3H10T1/2細(xì)胞接種于 24 孔板，10% FBS鈣鹽培養(yǎng)液(含有50 mg/L抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸二鈉鹽)與條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)21 d, 茜素紅S染色(棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次，0.05%戊二醛溶液固定10 min，棄固定液，ddH2O洗滌3次，每孔加入200 μL 0.05%茜素紅S，顯微鏡觀察，待出現(xiàn)紅色顆粒物質(zhì)堆積時(shí)，棄染液，加入ddH2O終止反應(yīng))，記錄鈣鹽沉積情況。

1.2.7 增殖能力的檢測： 將C3H10T1/2細(xì)胞接種于 24 孔板條件培養(yǎng)24 h后，顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞增殖情況。

1.2.8 Western blot檢測RUNX2、PCNA、磷酸化及總ERK1/2蛋白表達(dá)： 將C3H10T1/2細(xì)胞接種于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，條件培養(yǎng)24 h后提取總蛋白。蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉液封閉2 h，一抗置于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，37 ℃孵育二抗1h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影。Image J軟件分析電泳條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，得出蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ad-SHOX2成功構(gòu)建

PCR篩選結(jié)果(圖1A)，片段大小符合，且無非特異性條帶，測序穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-SHOX2，對比序列正確。瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組質(zhì)粒(圖1B)，PacⅠ酶切進(jìn)一步鑒定(圖1C)，正確重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)4.5 kb或者3 kb片段。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，第5天觀察到紅色熒光量較高(圖1D)。

2.2 SHOX2對BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化影響

ALP染色及定量結(jié)果(圖2A,B)，Ad-SHOX2組與BMP9組較NC組ALP活性顯著增加，且BMP9+Ad-SHOX2組較前兩組ALP活性明顯升高(P<0.05)。鈣鹽沉積結(jié)果(圖2C)，與NC組相比，Ad-SHOX2組與BMP9組增多。低感染率SHOX2處理后(圖2Cb)，BMP9+Ad-SHOX2組較前兩組鈣鹽堆積減少。此外，高感染率SHOX2處理后(圖2Ca)，BMP9+Ad-SHOX2組較BMP9組鈣鹽結(jié)節(jié)增多，與Ad-SHOX2組無明顯差異。

2.3 SHOX2促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞增殖

顯微鏡下觀察顯示(圖3A)，Ad-SHOX2組、BMP9組及BMP9+Ad-SHOX2組細(xì)胞密度均高于NC組。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果表明(圖3B)，BMP9+Ad-SHOX2組PCNA蛋白表達(dá)顯著高于BMP9組(P<0.05)。

2.4 MAPK/EKR信號通路可能參與SHOX2對C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化調(diào)控

Western blot檢測結(jié)果(圖4)，與NC組相比，Ad-SHOX2組和BMP9組RUNX2蛋白水平顯著上調(diào)，但BMP9+Ad-SHOX2組RUNX2蛋白表達(dá)高于BMP9組，低于Ad-SHOX2組(P<0.05)。此外，Ad-SHOX2組及BMP9+Ad-SHOX2組較NC組T-ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。

3 討論

有報(bào)道，在軟骨發(fā)育中，Ⅱ型膠原α1鏈驅(qū)動(dòng)的Cre條件性敲除Shox2小鼠表現(xiàn)出早熟的軟骨細(xì)胞成熟和肥大引起的股骨及肱骨縮短，其標(biāo)志物RUNX2、印度刺猬蛋白、X型膠原蛋白α1鏈表達(dá)水平上調(diào)[5]。而過氧化物還原酶1驅(qū)動(dòng)的Shox2敲除小鼠則引起軟骨成熟肥大滯后，以上標(biāo)志物表達(dá)水平下調(diào)，并且指出SHOX2作為RUNX2上游調(diào)控子從而調(diào)節(jié)軟骨分化過程[8]。以上研究表明SHOX2與RUNX2存在一定聯(lián)系。成骨分化中，RUNX2是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控成骨相關(guān)基因如骨鈣素，骨橋蛋白，Ⅰ型膠原等[9]。但SHOX2對BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響尚不清楚。本文通過C3H10T1/2細(xì)胞體外試驗(yàn)觀察到在沒有外源性成骨刺激因子條件下，鈣鹽沉積試驗(yàn)表明SHOX2過表達(dá)C3H10T1/2細(xì)胞自發(fā)成骨，RUNX2蛋白表達(dá)顯著上調(diào), 且SHOX2顯著促進(jìn)其增殖能力。而BMP9+Ad-SHOX2組RUNX2蛋白表達(dá)低于Ad-SHOX2處理組，表明BMP9可能抑制SHOX2的功能。同時(shí)，在低感染率Ad-SHOX2與BMP9處理后，鈣鹽沉積明顯低于BMP9組，表明SHOX2可能抑制BMP9的作用。以上提示SHOX2與BMP9對成骨分化的調(diào)控作用是否可能互為拮抗，有待進(jìn)一步研究。MAPK/EKR信號通路在細(xì)胞增殖分化中具有重要作用。據(jù)報(bào)道，EKR1/2缺陷的小鼠展現(xiàn)出嚴(yán)重的肢體畸形和骨骼缺損，提示EKR1/2對骨形成具有重要作用[10]。成骨早期分化中，EKR可與RUNX2結(jié)合， 磷酸化RUNX2脯氨酸/絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域的 Ser301和Ser319位點(diǎn)，提高RUNX2轉(zhuǎn)錄活性[11-12]。同時(shí)，在晚期分化中，EKR可激活RSK2酶，后者進(jìn)一步磷酸化并激活A(yù)TF4進(jìn)而促進(jìn)骨基質(zhì)形成[13]。本文檢測MAPK/EKR信號通路關(guān)鍵分子EKR1/2，發(fā)現(xiàn)其磷酸化及總蛋白水平均顯著上調(diào)。以上結(jié)果提示在C3H10T1/2細(xì)胞中，過表達(dá)SHOX2可加速其增殖及成骨分化，這一過程可能與MAPK/EKR信號通路相關(guān)。

A.SHOX2 screening PCR potential pAdTrace-TO4-SHOX2 was indicated by red arrow; B.candidate recombinant; C.Pac Ⅰ restriction endoculease digestion of candidate recombinant in lane 3(size of bands indicated by red arrows was annotated); D.transfected HEK293 cells were examined in lane 2(size of the band indicated by red arrow was annotated) under fluorescence field 5 days after transfection圖1 Ad-SHOX2的構(gòu)建Fig 1 Construction of Ad-SHOX2

A:ALP staining asssay; B:ALP quantification assay; C:Ca2+ deposition assay, a.high infection of Ad-SHOX2, b.low infection of Ad-SHOX2; *P<0.05, **P<0.001 compared with NC group圖2 SHOX2對BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞早晚期成骨分化影響Fig 2 Effects of SHOX2 on BMP9-induced early and late osteogenic differentiation in C3H10T1/2 n=3)

A.cell proliferation was observed using microscope(×40); B.PCNA protein expression was detected by Western blot;(scale bar=250 μm; *P<0.05, **P<0.001 compared with NC group圖3 SHOX2對C3H10T1/2細(xì)胞增殖能力的影響Fig 3 Effects of SHOX2 on cell proliferation ability of C3H10T1/2 n=3)

A.Western blot was used to evaluate protein expressions of RUNX2, p-ERK1/2, T-ERK1/2; B.statistical results of A; *P<0.001 compared with NC group; #P<0.001 compared with BMP9+Ad-SHOX2 group圖4 SHOX2對MAPK/ERK信號通路的影響Fig 4 Effects of SHOX2 on MAPK/ERK signaling n=3)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2中，SHOX2與BMP9對成骨分化的調(diào)控作用可能互為拮抗。而SHOX2可能通過調(diào)控RUNX2及MAPK/EKR信號通路從而促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨分化，這為骨再生提供一定參考資料，但還需深入研究其機(jī)制。