郭艷芹，殷博凱，張 娟，何 治

(三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002)

腦缺血(cerebral ischemia，CI)作為發(fā)病率最高的腦血管疾病，臨床治療僅為有限的靜脈溶栓及血管內(nèi)治療以再通栓塞的血管。然而，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，再灌注后往往會(huì)繼發(fā)不同程度的腦損傷，即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)，嚴(yán)重影響患者的生存率及存活后的功能恢復(fù)。因此，從CIRI病生機(jī)制及調(diào)控策略入手，尋求新的治療靶向及相關(guān)藥物尤其迫切。

氧化應(yīng)激、鈣離子超負(fù)荷、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放、血管內(nèi)皮功能障礙以及炎性反應(yīng)等多種病理過(guò)程參與了CIRI。中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)炎性小體的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別多種病原體和宿主衍生的細(xì)胞損傷信號(hào)，促進(jìn)級(jí)聯(lián)放大的炎性組織損傷。其中含有NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)蛋白并在其N(xiāo)端含有一個(gè)pyrin結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)的蛋白質(zhì)3為胞內(nèi)PRRs， 它形成的NLRP3(NODlike receptor protein 3)多蛋白復(fù)合物即為NLRP3炎性小體(NLRP3 inflammasome)。由于對(duì)NLRP3炎性小體探討最為深入，因此，本文從NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)功能及活化相關(guān)機(jī)制入手，著重闡述腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)后它的負(fù)向調(diào)控機(jī)制，以期為CIRI后的靶向治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 NLRP3炎性小體

NLRP3是NLR蛋白家族中NLRP(NOD-like receptor protein)亞家族成員之一。激活后，它通過(guò)N端PYD與銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein，ASC)PYD相互作用募集ASC以及胱天蛋白酶1的前體(pro-caspase-1)，形成NLRP3炎性小體[1]。

1.1 NLRP3炎性小體的功能

NLRP3炎性小體的活化促進(jìn)了下游促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟及釋放，以及隨后的快速的炎性溶解性程序性細(xì)胞死亡。它的異?；罨瘏⑴c了狼瘡性腎炎[2]、敗血癥、腹膜炎[3]、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移[4]、阿爾茨海默病[5]等自身免疫性疾病、炎性疾病、癌轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

1.2 腦缺血再灌注(I/R)后NLRP3炎性小體的表達(dá)

NLRP3炎性小體的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，主要表達(dá)在免疫器官及免疫細(xì)胞中，因此，腦I/R后小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。而體外培養(yǎng)的神經(jīng)元[6]及巨噬細(xì)胞[7]予以氧糖剝奪復(fù)氧模擬體內(nèi)腦I/R后，檢測(cè)NLRP3蛋白等炎性小體組分以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，也驗(yàn)證了它在腦組織及細(xì)胞中的分布和表達(dá)[6-7]。

2 NLRP3炎性小體的調(diào)控機(jī)制

NLRP3炎性小體可以通過(guò)3種途徑即經(jīng)典的、非經(jīng)典的以及替代的途徑來(lái)活化。其中，經(jīng)典的活化途徑是通過(guò)危險(xiǎn)信號(hào)或病原體等啟動(dòng)核因子κB(nuclear-factor κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的NLRP3及IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)，在內(nèi)環(huán)境紊亂、線粒體損傷致ROS的大量生成、溶酶體損傷等激活因素下，促進(jìn)NLRP3炎性小體的組裝及活化；非經(jīng)典活化途徑是由小鼠的caspase-11或人類(lèi)的caspase-4和caspase-5介導(dǎo)的pannexin 1(panx1)通道開(kāi)放引起鉀離子流出，最終活化它的方式，如利什曼原蟲(chóng)膜糖結(jié)合物脂磷酸聚糖觸發(fā)casepase-11并最終活化NLRP3炎性小體[8]；替代NLRP3炎性小體活化途徑是由casepase-8等參與的活化途徑，該途徑研究較少，仍在初步探索中。由于經(jīng)典的NLRP3炎性小體研究最為深入透徹，因而，本文主要圍繞這一途徑來(lái)闡述。

2.1 經(jīng)典的NLRP3炎性小體的活化機(jī)制

NLRP3的基礎(chǔ)表達(dá)水平對(duì)于炎性小體的活化而言太低，因此，需要啟動(dòng)刺激來(lái)轉(zhuǎn)錄NLRP3 mRNA并將該mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，在激活劑的刺激下組裝成NLRP3炎性小體，介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)放大的炎性反應(yīng)。所以，經(jīng)典的NLRP3炎性小體的活化機(jī)制分為啟動(dòng)階段和激活階段兩個(gè)過(guò)程。

2.1.1 NLRP3 炎性小體的啟動(dòng):NLRP3通過(guò)識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和/或(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，促進(jìn)NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)易位及轉(zhuǎn)錄，最終增加細(xì)胞內(nèi)NLRP3、pro-IL-1β及pro-IL-18的表達(dá)，為后期激活階段給予基本的物質(zhì)條件。

2.1.2 NLRP3炎性小體的激活:NLRP3被激活劑觸發(fā)后，轉(zhuǎn)為有活性NLRP3，募集ASC和pro-caspase-1形成NLRP3炎性小體。炎性小體的形成促進(jìn)了pro-caspase-1自我裂解成為活性caspase-1，后者將pro-IL-1β和pro-IL-18加工成為成熟的IL-1β和IL-18并釋放，最終放大炎性反應(yīng)并致使損傷后果加重。

2.2 NLRP3炎性小體活化的調(diào)節(jié)因子

NLRP3炎性小體對(duì)多系統(tǒng)疾病的影響越來(lái)越受到人們的重視，因而其活化的調(diào)節(jié)因子的探討也成為了焦點(diǎn)?；谀壳皩?duì)其活化等相關(guān)機(jī)制的理解，探討了多類(lèi)調(diào)節(jié)因子，其中PKR、GBP5及NEK7被廣泛認(rèn)為參與了NLRP3炎性小體活化的調(diào)節(jié)，但調(diào)節(jié)機(jī)制及作用仍未完全闡述清楚，甚至存在爭(zhēng)議，需要更加深入的研究來(lái)證實(shí)。

2.2.1 蛋白激酶R(protein kinase R， PKR):PKR是雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)依賴的蛋白激酶，為真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)之一，其N(xiāo)-末端含有兩個(gè)dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRNA binding domain，DRBD)，它通過(guò)DRBD與dsRNA或其他含DRBD的蛋白質(zhì)結(jié)合。PKR通過(guò)與PACT(PKR的活化劑)結(jié)合使TAR RNA結(jié)合蛋白(TAR RNA binding protein,TRBP)對(duì)PACH的限制作用被解除而活化PKR，達(dá)到整合應(yīng)激反應(yīng)及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的作用，而木犀草素卻能與PACT作用而使PKR 磷酸化抑制，消除對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的整合及促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，卻以不依賴PKR的方式增加炎性小體的活化[9]。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，PKR參與了高糖中存活的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3激活，抑制PKR有效降低NLRP3炎性小體的激活，該作用是通過(guò)其上游的cAMP激活的交換蛋白(exchange protein activated by cAMP 1，Epac1)對(duì)PKR的磷酸化調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。目前大部分研究表明，在大多數(shù)細(xì)胞中，PKR為NLRP3炎性小體的激活因子。

2.2.2 鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5(GBP5)：鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5(guanylate binding protein 5，GBP5)屬于GBP家族，涉及了囊泡運(yùn)輸、翻譯等多種重要的細(xì)胞過(guò)程。它能激活NF-κB通路并通過(guò)與NLRP3的PYD相互作用促進(jìn)ASC寡聚化，因此確定為NLRP3-ASC組裝的獨(dú)特活化劑，促進(jìn)NLRP3炎性小體的組裝[11]。在近幾年的研究中證明了IFN誘導(dǎo)蛋白IRGB10在響應(yīng)細(xì)菌感染過(guò)程中通過(guò)GBPS靶向介導(dǎo)革蘭陰性菌破壞胞膜的穩(wěn)定性釋放炎性小體激活配體來(lái)活化NLRP3炎性小體，至于GBPS亞型尚不清楚[12]。 因此，GBP5對(duì)NLRP3炎性小體的正向調(diào)節(jié)效應(yīng)尚待更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

2.2.3 NIMA相關(guān)激酶 7(NIMA-related kinase 7，NEK7)：NEK7屬于保守的NIMA相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶(NEK)家族，由于這個(gè)家族共有一個(gè)保守的N末端激酶結(jié)構(gòu)域以及不同的C末端尾部，使得它們生理功能不同。NEK7在細(xì)胞有絲分裂中的作用已廣為人知，而最近有學(xué)者通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明NEK7響應(yīng)于NLRP3的激活刺激與NLRP3蛋白的相互作用形成NLRP3-NEK7復(fù)合體作用于鉀流出的下游增強(qiáng)NLRP3炎性小體的活化[13]。

3 腦I/R后NLRP3炎性小體的調(diào)控

腦缺血后機(jī)體氧氣和能量的供應(yīng)中斷，再灌注后活性氧族(reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞活化了NLRP3炎性小體并促使隨后促炎細(xì)胞因子的大量釋放，形成級(jí)聯(lián)放大的炎性反應(yīng)惡化CIRI的不良后果。因此，對(duì)腦I/R后NLRP3炎性小體的合理調(diào)控可以達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能、改善預(yù)后的效果。

3.1 腦I/R后NLRP3炎性小體活化的啟動(dòng)調(diào)控

NLRP3是活化炎性小體的限速元件[14]，因而阻止NF-κB的轉(zhuǎn)錄可達(dá)到調(diào)控NLRP3炎性小體啟動(dòng)的目的。正常情況下，NF-κB被κB蛋白的抑制劑(inhibitor of kappa B，IκB)隔離在細(xì)胞質(zhì)中，激活NF-κB途徑以后，IκBα特定的絲氨酸殘基被IkB激酶復(fù)合物磷酸化降解進(jìn)而消除了其對(duì)NF-κB的限制，使NF-κB向胞核易位并與κB啟動(dòng)子序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[15]。而在轉(zhuǎn)錄翻譯后，則可以通過(guò)microRNA-20b直接靶向NLRP3蛋白或通過(guò)NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950抑制小體活化的啟動(dòng)來(lái)調(diào)控腦缺血后的炎性反應(yīng)[16-17]。

3.2 腦I/R后NLRP3炎性小體活化的激活調(diào)控

NLRP3炎性小體活化的激活調(diào)控在于抑制激活因素以及抑制小體的組裝。在眾多的激活因素中，找尋多種激活因素共同作用的下游通路有可能為開(kāi)發(fā)出新一代的特異性抑制劑提供思路。

而通過(guò)抑制炎性小體組裝來(lái)抑制其活化的并不多見(jiàn)，從CIRI方面著手的研究則更少。一方面，可以通過(guò)抑制NLRP3炎性小體各組分的形成及相互作用抑制其活化，如作用于NLRP3或抑制ASC斑點(diǎn)形成或抑制兩者之間的相互作用等。酪氨酸激酶通過(guò)作用于NLRP3和ASC的物理作用，在體外以激酶活性依賴性方式誘導(dǎo)了ASC寡聚化和caspase-1活化從而活化NLRP3炎性小體，而其抑制劑依魯替尼(Ibrutinib)在腦I/R模型中則通過(guò)抑制caspase-1的活化從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用的目的[18]。NLRP3抑制劑CY-09能直接與NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合基序結(jié)合從而抑制NLRP3 ATP酶活性，達(dá)到特異性抑制NLRP3炎性小體的組裝和活化的目的，其治療效果在冷凍蛋白相關(guān)自身炎性反應(yīng)綜合征和2型糖尿病的小鼠模型中已經(jīng)得到驗(yàn)證[19]，但在CIRI后治療效果知之甚少。最近的研究表明，在應(yīng)激條件下，應(yīng)激顆粒和NLRP3炎性小體競(jìng)爭(zhēng)DDX3X分子(應(yīng)激顆粒蛋白的組分)，以決定ASC斑點(diǎn)的形成及隨后NLRP3炎性小體的活化與否，最終決定細(xì)胞的存亡[20]。而楊梅素(myricetin)卻通過(guò)泛素化修飾小體組分蛋白如NLRP3及ASC，同樣也達(dá)到了抑制炎性小體組裝的目的[21]。

另一方面，可以通過(guò)抑制NLRP3炎性小體活化的調(diào)節(jié)因子來(lái)抑制其活化。目前的研究表明，這種調(diào)控機(jī)制幾乎作用于NLRP3炎性小體的激活機(jī)制上，即抑制它的組裝，而對(duì)于其內(nèi)部各組分蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響。青蒿素(artemisinin)為一種廣為人知的抗瘧疾劑，在尿酸誘導(dǎo)的痛風(fēng)模型中可以通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3與NEK7的相互作用抑制NLRP3炎性小體的活化進(jìn)而達(dá)到抗炎的作用[22]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Omega-1(GSTO1-1)使半胱氨酸253上的NEK7脫谷胱甘肽化以促進(jìn)NLRP3炎性小體激活，而其抑制劑則阻斷了這一過(guò)程[23]。盡管這些機(jī)制為目前的研究提供了一些方向，但只是在某些模型中得到證實(shí)。

除此之外，姜根莖中外泌體樣納米顆粒阻斷NLRP3炎性小體的組裝，強(qiáng)烈地抑制其活化[24]，但其機(jī)制并不明確。雖然依據(jù)對(duì)其活化機(jī)制的理解，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以從許多的關(guān)鍵點(diǎn)上調(diào)節(jié)炎性小體的活化，但是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尤其是腦I/R后的研究仍有待學(xué)者進(jìn)一步發(fā)掘。

4 問(wèn)題與展望

腦I/R后炎性小體的活化參與CIRI后病理生理過(guò)程，加重了腦缺血后不良結(jié)局。目前的研究表明，除了NLRP3炎性小體外，其他炎性小體也參與了這一過(guò)程，究竟哪種炎性小體扮演著最重要的角色，各個(gè)炎性小體之間相互作用如何，仍需要后期進(jìn)一步的研究來(lái)解釋。而基于對(duì)NLRP3炎性小體的研究，由于目前在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中取得的進(jìn)展仍難以應(yīng)用到臨床，因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)支撐和更深入的研究成果來(lái)指導(dǎo)CIRI后的治療，以期攻克CI不良預(yù)后的難關(guān)。