張 偉,馬培芳,李延龍,王雅麗,王繼蕓,張華敏,陳建華, 尹守恒,李克寒

(河南省韭菜工程技術(shù)研究中心/平頂山市農(nóng)業(yè)科學院，河南 平頂山 467001)

氨基酸是蛋白質(zhì)的組成基本單位，是人體必需的營養(yǎng)。而韭菜葉片中富含游離氨基酸是用來描述韭菜葉片營養(yǎng)價值的一個重要品質(zhì)指標。韭菜主食葉片，進行游離氨基酸總量的測定是對韭菜葉片氨基酸營養(yǎng)的確定。航研998與平韭2號都是比較新出的品種，所以以這兩個品種作為實驗材料。

游離氨基酸與水合茚三酮反應，產(chǎn)生二酮茚—二酮茚胺藍紫色化合物。在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與游離氨基酸含量成正比，可以用紫外可見分光光度計，在570 nm下測得藍紫色溶液的吸光度，然后根據(jù)標準曲線計算樣品中游離氨基酸的含量。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、儀器和試劑。

1.1.1 材料 新鮮韭菜葉片

1.1.2 儀器 主要有:

(1)研缽、漏斗、三角瓶、濾紙 、容量瓶(50 mL, 100 mL);

(2)橡膠塞刻度試管50 mL;

(3)移液槍200 μL、1 000 μL、5 000 μL;

(4)沸水浴電磁爐;

(5)UV-1600紫外可見分光光度計;

(6)分析天平。

1.1.3 試劑 主要有:

(1)10%乙酸。

(2)水合茚三酮試劑：稱取0.6 g茚三酮加入15 mL正丙醇，再加入30 mL正丁醇及60 mL乙二醇溶解，最后在加入9 mL pH5.4乙酸—乙酸鈉緩沖液，混勻，貯于250 mL 廣口棕色瓶于冰箱冷藏室內(nèi)保存，10 d內(nèi)有效。

(3)乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH5.4)：稱取32.56 g乙酸鈉(NaAc)，加入超純水加熱至沸，冷卻后加30 mL冰乙酸，用超純水定容至100 mL。

(4)氨基酸標準液：稱取80℃烘干的L-亮氨酸(生物技術(shù)級)46.8 mg，以10%異丙醇溶解，并定容至100 mL，取此液5 mL用超純水稀釋至50 mL，即為每毫升含氨基氮5 ug的標準液。

(5)0.1%的抗壞血酸：50 mg溶于50 mL超純水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(6)60%乙醇[1]。

1.2 操作步驟

1.2.1 標準曲線制作 取6支50 mL刻度試管，按表1加入試劑后，混勻，蓋上橡膠塞，置沸水浴中15 min，然后取出在冷水浴中迅速冷卻，直到溶液呈藍藍紫色時，用60%乙醇定容至20 mL，搖勻，在570 nm下測吸光度。

表1 標準曲線的吸光度測定

表2 吸光度的計算

1.2.2 樣品提取 新鮮葉片擦干凈，取中部剪碎，稱0.15 g，于研缽中加10%乙酸1.5 mL，研磨，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水定容，然后在用干濾紙過濾至三角瓶中。

1.2.3 樣品測定 樣品濾液1 ml吸入20 mL具塞刻度試管中，加超純水1 mL，水合茚三酮3 mL，0.1%抗壞血酸0.1 mL，顯色、比色同標準曲線方法。并根據(jù)吸光度在標準曲線位置上計算出樣品的含氮量X(ug)。

2 結(jié)果與分析

按照下式計算出100 g鮮樣中氨基態(tài)氮的含量：

氨基態(tài)氮含量(mg·100g-1鮮樣)=

2.1 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如表2。

表4 平韭2號與航研998的不同收割天數(shù)與每百克葉片的氨基態(tài)氮計算結(jié)果

2.2 結(jié)果分析

從實驗結(jié)果看，航研998的百克葉片中游離氨基酸總量比平韭2號的多，也可以認為其游離氨基酸總量營養(yǎng)價值比平豐2號較高。在收割時比較航研998長勢比平韭2號強許多，直立性好，分蘗性強?？傊窖?98與平韭2號在各方面相比較表現(xiàn)出來的是一個好品種。

3 討 論

由于蛋白質(zhì)和多肽中的游離氨基酸也會產(chǎn)生茚三酮的還原反應，因此，對于含大量蛋白質(zhì)和多肽的樣品，可以先用蛋白質(zhì)沉淀劑將其除去。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有10%乙酸，且乙酸提取總氨基酸的效果較好。

(1)實驗用水為超純水，若無可用無氨蒸餾水代替。

(2)實驗中以抗壞血算為還原劑，可提高反應的靈敏度，并使顏色穩(wěn)定，由于抗壞血酸可與茚三酮反應，使溶液顏色過深，需要掌握加入抗壞血酸的量，而且抗壞血酸必須現(xiàn)用現(xiàn)配。

(3)該反應需要脫水縮合，反應介質(zhì)中水的多少不但對終點產(chǎn)物的濃度有很大影響，而且還會影響終點產(chǎn)物的穩(wěn)定性[2]。因此，反應完后在反應中加入定量60%乙醇，用來穩(wěn)定反應產(chǎn)物。

(4)水合茚三酮與氨基酸反應所生成的二酮茚—二酮茚胺在1h內(nèi)是穩(wěn)定的，故顯色后的溶液加入60%乙醇稀釋后盡快比色。