高啟軍，鄧長金

急性ST段抬高型心肌梗死多為血管完全閉塞，持續(xù)性心肌缺血可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，盡早開通閉塞血管恢復(fù)血流灌注可以降低心肌細(xì)胞壞死，是最有效的治療方法[1]。但缺血后再灌注可因一系列原因出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷，引起心肌細(xì)胞凋亡，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前還未完全闡明[2]。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，是心肌缺血再灌注損傷的主要原因[3]。在心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制包括活性氧大量生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷等，同時一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控基因也影響心肌細(xì)胞凋亡的過程。最重要的凋亡調(diào)控基因是Bcl-2 基因家族，而Bax和Bcl-2的相互作用又是其中最為關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡調(diào)控因素。Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡，而 Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)來防止細(xì)胞凋亡，是治療缺血再灌注損傷的方法之一。

Sigma-1受體是近幾年研究的熱點(diǎn)之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他周邊組織中廣泛表達(dá)。這些受體與神經(jīng)變性疾病、抑郁癥、特發(fā)性疼痛和癌癥有關(guān)，已成為治療這些疾病的新靶點(diǎn)[4]。最近的研究表明，Sigma-1受體激動劑具有心肌保護(hù)作用[5-6]。目前Sigma-1受體激動劑的研究主要集中于抑郁合并心血管疾病，而且研究時間較長，多為干預(yù)1個月，但其對缺血再灌注損傷的影響尚不清楚。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察Sigma-1受體激動劑PRE-084對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 SD雄性大鼠，SPF級，體重220～250 g，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號：SCXK鄂2015-0018。PRE-084購自美國stanta公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將15只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、PRE-084組，每組5只。PRE-084組于手術(shù)前1 h給予1 mg/kg PRE-084；假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等體積的生理鹽水，均為腹腔注射給藥，實(shí)施30 min缺血及24 h再灌注造模；假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型制作及樣本獲取 大鼠腹腔注射麻醉(10%水合氯醛3 mL/kg)，氣管插管后連接上小動物呼吸機(jī)，設(shè)置頻率為60次/min，潮氣量為2 mL/100 g，在胸骨左側(cè)開胸，結(jié)扎冠狀動脈左前降支中上1/3處。觀察到結(jié)扎點(diǎn)的遠(yuǎn)端心肌變蒼白、心電監(jiān)護(hù)提示ST段抬高為造模成功，缺血30 min后，松開結(jié)扎線，恢復(fù)冠狀動脈灌注，觀察約10 min后逐層縫合。再灌注24 h后再次麻醉大鼠，剪開胸腔后取出心臟，去除心房、右心室，將左室分為兩塊，一塊放入4%多聚甲醛中固定，用于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡，另一塊放入-80 ℃冰箱中，擇期行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢查。

1.3.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL法) 凋亡細(xì)胞斷裂的基因組DNA暴露的3′-OH可以連上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水處理后，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色。以 TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量與同一視野心肌細(xì)胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.3.3 熒光RT-PCR 檢測Sigma-1受體、Bcl-2、Bax mRNA水平 于冰上取約100 mg組織，于1 mL 預(yù)冷的Trizol中充分研磨，按 Trizol 說明書提取組織總 RNA，經(jīng) RNA 濃度和純度測定后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Sigma-1受體引物序列：正向引物5′- GCAGTGGGTGTTTGTGAACG-3′，反向引物5′- TCTCAGCCCAGTATCGTCCC-3′；Bax 引物序列：正向引物5′- TGAACTGGACAACAACATGGAG-3′，反 向引物5′- AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3′；Bcl-2 引物序列：正向引物5′- TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，反 向引物 5′- TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3′；β- 肌動蛋白(β-actin)引物序列：正向引物 5′- CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，反向引物 5′- TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。實(shí)時熒光定量PCR是在StepOneTMReal-Time PCR儀(Life technologies公司)上完成，每個樣品均作3個復(fù)孔，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織TUNEL檢測結(jié)果(見圖1、圖2) 按TUNEL試劑盒提供的方法檢測凋亡細(xì)胞，假手術(shù)組凋亡細(xì)胞少，模型組可見大量凋亡細(xì)胞，PRE084組可見少量凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組、缺血再灌注組、PRE-084組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為0.04±0.01，0.38±0.05，0.16±0.03，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=138.20，P=0.001)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組與PRE-084組凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與缺血再灌注組相比，PRE-084組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明缺血再灌注損傷可引起心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，而PRE-084預(yù)處理能減少心肌細(xì)胞凋亡。

圖1 3組熒光顯微鏡下心肌細(xì)胞凋亡情況

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與缺血再灌注組比較，#P<0.01。

2.2 3組大鼠心肌Sigma-1受體 mRNA表達(dá)比較 PRE-084組、缺血再灌注組Sigma-1受體 mRNA 表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯下降(P<0.01)，與缺血再灌注組比較，PRE-084組Sigma-1受體 mRNA 表達(dá)上升(P<0.01)。說明缺血再灌注可引起Sigma-1受體 mRNA表達(dá)下降，而PRE-084預(yù)處理能使Sigma-1受體 mRNA表達(dá)增加。詳見表1。

2.3 3組大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較 3組大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，PRE-084組及缺血再灌注組Bax mRNA表達(dá)均上升(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)均下降(P<0.01)，與缺血再灌注組相比，PRE-084組中Bax mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.01)。說明缺血再灌注可引起B(yǎng)cl-2下降、Bax上升，相應(yīng)的Bcl-2/Bax比值下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而PRE-084預(yù)處理使Bcl-2上升、Bax下降，相應(yīng)的Bcl-2/Bax比值上升，抑制細(xì)胞凋亡。詳見表1。

表1 3組大鼠心肌Sigma-1受體、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察Sigma-1受體激動劑PRE-084對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響；使用RT-PCR法測定Bax、Bcl-2及Sigma-1受體mRNA 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在心肌缺血再灌注前應(yīng)用PRE-084干預(yù)，可以抑制心肌細(xì)胞凋亡；PRE-084在心肌缺血再灌注中通過Sigma-1受體調(diào)控Bcl-2及Bax基因表達(dá)水平來干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌在病理因素的作用下發(fā)生的主動而有序的程序性死亡。缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制是多因素性的，凋亡是再灌注損傷的主要致病機(jī)制之一[7]。當(dāng)心臟處于超負(fù)荷或心肌缺血等病理狀態(tài)時，可能誘發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。心肌細(xì)胞是不可再生的細(xì)胞，心肌細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡是減輕心肌梗死病人心肌損傷的有效途徑之一。本實(shí)驗(yàn)研究表明，缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡增多，而PRE-084預(yù)處理可減少心肌細(xì)胞凋亡。

凋亡是一種基因調(diào)控的程序性死亡，凋亡調(diào)節(jié)基因分為抑制凋亡基因和促凋亡基因。研究最多的凋亡調(diào)控基因是Bcl-2 基因家族[9]，其產(chǎn)物根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、功能不同分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白，抑制凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1、Bcl-w，促凋亡蛋白包括Bid、Bax、Bak、Bad，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白含量的多少決定對細(xì)胞凋亡調(diào)控的方向，其中Bcl-2和Bax的相互作用在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起重要作用[10]，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核模和線粒體膜。Bcl-2 和Bax對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，不僅受其表達(dá)的影響，而且受到 Bcl-2/Bax 比值的影響，Bcl-2/Bax 比值升高抑制凋亡發(fā)生，降低則促進(jìn)凋亡。研究表明，Bcl-2可在多處不同的層面抑制心肌細(xì)胞凋亡[11]，Bcl-2可抑制氧自由基的產(chǎn)生而降低氧自由基損傷；可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)細(xì)胞器的Ca2+而減輕鈣超載；還可以抑制線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔開放，從而抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2可直接和凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)結(jié)合，防止凋亡蛋白酶的激活；Bcl-2可與Bax結(jié)合形成二聚體，從而使Bax無法發(fā)揮促凋亡作用。而Bax作為Bcl-2的同源體，可抑制Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，可以通過干預(yù)Bcl-2/Bax的表達(dá)來阻斷細(xì)胞凋亡，從而減輕缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血再灌注使Bcl-2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)明顯上升；經(jīng)PRE-084預(yù)處理后，與缺血再灌注組相比Bcl-2升高，Bax下降，Bcl-2/Bax比值上升，提示PRE-084降低細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，PRE-084抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為通過增加激動Sigma-1受體增加Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)有關(guān)，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。