吳 翔，張婷婷，喬建峰，熊尚全

射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭(ejection fraction preserved heart failure，HFpEF)是以心臟舒張功能受損為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。目前，HFpEF在心力衰竭病人比例已超過50%，且呈升高趨勢(shì)。如何有效延緩和逆轉(zhuǎn)HFpEF病人進(jìn)程，改善轉(zhuǎn)歸，已成為慢性心力衰竭治療的最大挑戰(zhàn)[1]。中醫(yī)藥治療HFpEF療效確切，本研究通過構(gòu)建HFpEF大鼠模型，基于心肌纖維化角度，探討康達(dá)心口服液對(duì)HFpEF大鼠心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只無(wú)特定病原體級(jí)(SPF級(jí))SD大鼠，體重150～200 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均遵循動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 康達(dá)心口服液(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑)，主要成分：附子、黃芪、葶藶子、豬苓、當(dāng)歸；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體一抗和二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；N末端B型鈉尿肽原(NT-proBNP)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vigenebio公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)，TKR-200C廈門欣銳儀器儀表有限公司生產(chǎn)；Visual Sonic Vevo 2100?型小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)，加拿大Visual Sonics公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 HFpEF模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，高位結(jié)扎腹主動(dòng)脈以復(fù)制動(dòng)物模型。于大鼠腹部正中線開口，逐層開腹，暴露并分離腹主動(dòng)脈，以大鼠右側(cè)腎動(dòng)脈上方2～3 mm腹主動(dòng)脈處為結(jié)扎點(diǎn)，使用4-0的帶針線結(jié)扎，造成腹主動(dòng)脈結(jié)扎點(diǎn)內(nèi)徑縮窄；結(jié)扎后心臟表面即刻給予利多卡因注射液1～2滴，縫合關(guān)閉腹腔；關(guān)腹后腹腔滴注2%的青霉素/鏈霉素溶液。術(shù)后第12周，即造模HFpEF大鼠模型。假手術(shù)組給予相同手術(shù)方法，穿線但不結(jié)扎腹主動(dòng)脈。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將30只SD大鼠稱重后隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(sham組)、心力衰竭組(HFpEF組)、心力衰竭干預(yù)組(HFpEF+I組)。HFpEF+I組大鼠灌胃2.7 mL/(kg·d)康達(dá)心口服液；假手術(shù)組、心力衰竭組灌胃等量生理鹽水。3組大鼠均連續(xù)灌胃12周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心功能評(píng)估 治療12周后，應(yīng)用心臟超聲測(cè)量各組大鼠舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣扰c舒張晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)、舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣扰c舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)運(yùn)動(dòng)速度比值(E/e′)，評(píng)估大鼠心臟舒張功能，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組大鼠NT-proBNP水平，評(píng)估心功能。

1.3.2 心臟組織收集 處死大鼠前測(cè)量體重，處死后立即取出心臟，并測(cè)量心臟、左室重量，計(jì)算心臟重量/體重指數(shù)(Hw/W)、左室重量/體重指數(shù)(LVw/W)。取出1 mm3面積的心肌組織迅速置于10%的甲醛中固定24 h后，石蠟包埋組織切片(4 μm)，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，并觀察心肌組織膠原纖維含量、分布及心肌纖維化。

1.3.3 心肌纖維化評(píng)估 分別提取各組大鼠心臟組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并進(jìn)行制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影，數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Western Blotting分別檢測(cè)各組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較 與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠E/A比值明顯降低，NT-proBNP水平、E/e′升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組E/A比值升高，NT-proBNP水平、E/e′降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 3組大鼠心臟重量比較 與sham組比較，HFpEF組Hw/W、LVw/W均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組Hw/W、LVw/W均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.3 3組大鼠心臟組織纖維化比較 電鏡下觀察各組大鼠HE染色心肌組織，與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠心臟組織心肌纖維化程度增加；與HFpEF組比較，HFpEF+I組大鼠心臟組織心肌纖維化程度明顯減輕。詳見圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織心肌纖維化程度

2.4 3組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)比較 與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1及圖2。

圖2 3組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討 論

心肌纖維化導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降是HFpEF重要的病理生理機(jī)制，心肌纖維化尤其是早期心肌纖維化多影響心臟舒張功能[2-3]。在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常增多和過度沉積發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3]。TGF-β1促進(jìn)心肌纖維化作用得到證實(shí)。TGF-β1通過調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞和ECM代謝平衡，從而促進(jìn)心肌纖維化及HFpEF發(fā)生發(fā)展[4-7]。將小鼠TGF-β1基因剔除后，其胚胎發(fā)生和發(fā)育中出現(xiàn)血管缺陷[8]，提示TGF-β1不僅參與維持正常內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)[3]，而且在胚胎形成、纖維化和創(chuàng)傷愈合等過程中均參與血管發(fā)生[9-11]。

HFpEF屬中醫(yī)學(xué)“喘癥”“心水”“胸痹”等范疇，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，心為“君主之官”，主血脈，心之氣陽(yáng)不足，心血瘀阻，水飲內(nèi)停，痰飲為陰邪，心腎陽(yáng)虛不能化水，水飲上凌于心肺，則見氣促、咳嗽、咳痰，又常因外感、內(nèi)傷、勞累等加重。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HFpEF以陽(yáng)虛血瘀兼痰飲證者居多[12]?？颠_(dá)心口服液是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院根據(jù)多年經(jīng)驗(yàn)方制成的院內(nèi)制劑，君藥附子、黃芪溫腎暖土，益氣健脾；臣藥葶藶子、豬苓定逆止喘、滲泄水邪；佐藥當(dāng)歸溫通血脈、活血行氣。前期研究已證實(shí)，康達(dá)心口服液治療慢性心力衰竭療效顯著，其可能機(jī)制為降低慢性心力衰竭病人血清基質(zhì)金屬蛋白酶9水平，增強(qiáng)心肌收縮力，增加心排血量[13]；抑制細(xì)胞凋亡，降低腫瘤壞死因子α、白介素6水平，改善心臟重構(gòu)等[14-15]?；凇皽仃?yáng)益氣，化瘀利水”的治則，前期研究將康達(dá)心口服液應(yīng)用于HFpEF病人的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合康達(dá)心口服液能降低HFpEF病人E/e′，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平[16]。

本研究通過建立HFpEF大鼠模型，結(jié)果證實(shí)：康達(dá)心口服液可降低HFpEF大鼠E/e′比值，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)康達(dá)心口服液能降低HFpEF大鼠心臟組織TGF-β1表達(dá)，這可能是康達(dá)心口服液抑制心肌纖維化，改善心臟舒張功能的機(jī)制。今后將進(jìn)一步探討康達(dá)心口服液對(duì)心肌組織TGF-β1相關(guān)信號(hào)通路的影響，揭示康達(dá)心口服液治療HFpEF的具體機(jī)制。