鄭希院，趙志敏，薛林霞，趙龍斌

癲癇是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要是由多種原因?qū)е履X細(xì)胞群異常超同步化放電，造成突然性、暫時(shí)性及發(fā)作性腦功能紊亂，目前關(guān)于癲癇的發(fā)病機(jī)制未完全明確[1]。miR可調(diào)控細(xì)胞生物增殖、代謝、發(fā)育、凋亡、應(yīng)激、代謝等過(guò)程，與癲癇發(fā)生與發(fā)展等密切聯(lián)系，其中miR-146a是調(diào)控炎癥反應(yīng)及免疫的調(diào)控因子，在癲癇中發(fā)揮重要作用[2]。腦內(nèi)miR-124含量較多，在成熟及發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，miR-124可能參與調(diào)節(jié)突觸可塑性，且在異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成中調(diào)節(jié)神經(jīng)再生長(zhǎng)及軸突生長(zhǎng)[3]。白介素-1(interleukin-1，IL-1)在組織修復(fù)與免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[4]。雙皮質(zhì)素(double corte x，Dcx)是在多數(shù)樹(shù)突末端與軸突末端具有特殊的亞細(xì)胞位置，Dcx在神經(jīng)元移行過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育[5]。本研究分析癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年4月—2018年4月我院收治的癲癇病人90例，男51例，女39例，年齡10～47(28.5±5.5)歲；病程0.5～19(9.7±0.5)年；單純部分性發(fā)作19例，復(fù)雜部分性發(fā)作28例，全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作43例；單次發(fā)作(每個(gè)月<4次)36例，頻繁發(fā)作(每個(gè)月≥4次)54例；癲癇輕度(2個(gè)月發(fā)作1次)18例，中度(1個(gè)月發(fā)作<4次)29例，重度(1個(gè)月發(fā)作>4次)43例。另選取同期在我院進(jìn)行健康體檢者90名作為正常組，男49名，女41名；年齡8～48(28.2±4.7)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 癲癇發(fā)作類型及診斷標(biāo)準(zhǔn)符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)；癲癇診斷根據(jù)病人家族史、體格檢查、現(xiàn)病史、腦電圖、顱腦MRI或CT等相關(guān)檢查結(jié)果，并由神經(jīng)內(nèi)科專業(yè)醫(yī)師確診；所有癲癇病人或家屬知情并同意加入本研究。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并精神分裂癥、雙相障礙等其他精神疾病史病人；癲癇病人伴有神經(jīng)及其他系統(tǒng)疾?。宦?tīng)力、視力障礙及失語(yǔ)等病人；近期服用過(guò)抗焦慮抑郁情緒及影響認(rèn)知功能藥物的病人。

1.3 方法

1.3.1 IL-1水平檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血5 mL，置于一次性真空無(wú)抗凝劑的采血管中。20～25 ℃條件下進(jìn)行凝血60 min，之后以1 500 r/min離心20 min，分離血清，-80 ℃環(huán)境中保存待檢。IL-1水平采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定：緩沖液稀釋50 mol/L碳酸鹽包IL-1抗原，之后添加到聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，置于24 h溫度4 ℃，次日洗滌劑洗滌3次后，拋干。各孔中加入稀釋液稀釋的待測(cè)標(biāo)本0.1 mL，同時(shí)加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照標(biāo)本，42 ℃放置60 min，將液體移除洗滌3次后，拋干。各孔中加入IL-1酶標(biāo)抗體0.1 mL，43 ℃放置60 min。液體移去，洗滌3次，拋干。在各個(gè)孔中加入0.1 mol/L的Na2HPO4與0.05 mol/L枸櫞酸滴液混勻，再加入0.1 mL鄰苯二胺，遮光處理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)405，分析IL-1水平。

1.3.2 miR-146a、miR-124、Dcx水平檢測(cè) 按照TRIzol提取細(xì)胞RNA，總RNA濃度測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)，重復(fù)測(cè)定3次。按照QIAGEN進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取14 μL RNA，5×RT緩沖液4 μL，2 μL Enzyme mix，42 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃反應(yīng)5 min，cDNA合成后-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。使用ABI7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀按照說(shuō)明書將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，U6作為內(nèi)參，95 ℃ 15 s進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，95 ℃ 5 s，60 ℃退火加延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，調(diào)節(jié)基線，miRNA、miR-124、Dcx與內(nèi)參U6的相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組比較，癲癇組miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.2 不同性別的癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 男性癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量與女性癲癇病人比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同性別的癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.3 不同年齡的癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 <18歲癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量與≥18歲癲癇病人比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 不同年齡的癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.4 不同發(fā)作類型癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 與單純部分性發(fā)作比較，復(fù)雜部分性發(fā)作、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與復(fù)雜部分性發(fā)作比較，全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 不同發(fā)作類型癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.5 不同發(fā)作頻率癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 與單次發(fā)作比較，頻繁發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表5。

表5 不同發(fā)作頻率癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.6 不同發(fā)作程度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較 與輕度癲癇病人比較，中度、重度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中度癲癇病人比較，重度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 不同發(fā)作程度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

3 討 論

目前癲癇主要涉及癲癇病程、部位、發(fā)作類型及發(fā)作頻率，包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常及社會(huì)因素等[6]。癲癇病人不僅對(duì)發(fā)作癥狀治療與控制，還包括對(duì)癲癇病人精神性疾病及合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病管理[7]。有研究顯示，癲癇病人常見(jiàn)的合并癥是抑郁、焦慮與認(rèn)知功能障礙，若降低病人自我管理依從性與對(duì)抗癲癇藥物耐受性，病人可能增加意外死亡及自殺風(fēng)險(xiǎn)，給家庭與社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。癲癇發(fā)病電生理基礎(chǔ)是神經(jīng)元異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙[9]。癲癇發(fā)作臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要是由于異常放電的傳遞方式與起始部位不同，臨床表現(xiàn)為精神障礙、發(fā)作性運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)等[10]。癲癇與炎性因子互相發(fā)展、促進(jìn)，炎性因子促進(jìn)癲癇發(fā)作與神經(jīng)細(xì)胞興奮，而癲癇發(fā)作也引起炎癥反應(yīng)[11]。

miRNA參與細(xì)胞胚胎發(fā)育、增殖、凋亡與分化等重要的過(guò)程，與下游靶基因和上游調(diào)控因子之間形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。miR-146a在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其在腦組織與炎癥反應(yīng)密切關(guān)系[12]。miR-124參與軸突生長(zhǎng)與神經(jīng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，降低α-微管蛋白表達(dá)[13-14]。miR-124影響認(rèn)知功能是由于其參與突觸長(zhǎng)時(shí)程可塑調(diào)節(jié)，在癲癇病人中呈高表達(dá)，參與癲癇后突觸重塑過(guò)程[15]。IL-1是一種促炎細(xì)胞因子，癲癇后通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的間接作用或通過(guò)對(duì)神經(jīng)元的直接作用參與癲癇形成過(guò)程，是由于通過(guò)加強(qiáng)谷氨酸神經(jīng)傳遞，提示炎癥反應(yīng)對(duì)癲癇發(fā)生與發(fā)展發(fā)揮重要作用[16-17]。Dcx在多數(shù)樹(shù)突與軸突末端發(fā)揮抑制作用，它影響配體復(fù)合物，提示在神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，癲癇組病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量升高。說(shuō)明癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相對(duì)表達(dá)量更高。

本研究結(jié)果顯示，與單純部分性發(fā)作比較，復(fù)雜部分性發(fā)作、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高；與復(fù)雜部分性發(fā)作比較，全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高。說(shuō)明全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平更高。張淑紅等[19]等研究顯示，在癲癇大鼠模型發(fā)作后，馬海組織miR-146a在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化區(qū)域內(nèi)表達(dá)量較高，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，與單次發(fā)作比較，頻繁發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平表達(dá)升高。說(shuō)明頻繁發(fā)作癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平更高。相關(guān)研究表明，炎性遞質(zhì)可調(diào)節(jié)興奮性氨基酸釋放，提高神經(jīng)元細(xì)胞興奮性，促進(jìn)癲癇發(fā)作[20]。本研究結(jié)果顯示，與輕度比較，中度、重度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高；與中度比較，重度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高。說(shuō)明重度癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx表達(dá)水平更高。

綜上所述，癲癇病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與發(fā)作頻繁、發(fā)作類型、發(fā)作程度相關(guān)，miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx在癲癇病人中起到重要的參與作用。