黃杰勛，王漢林，黃衛(wèi)東，劉先利*

(湖北理工學(xué)院 a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，b.礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c.化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435003)

2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)作為硝基芳香化合物的典型代表物之一，被廣泛應(yīng)用于制造推進(jìn)劑、聚氨酯、炸藥、殺蟲(chóng)劑、染料等化學(xué)品[1]。由于其具有較強(qiáng)的致癌性，在生產(chǎn)和使用過(guò)程中的不當(dāng)處置會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的土壤或水體污染問(wèn)題[2]。

硝基具有較強(qiáng)的吸電子能力，這導(dǎo)致2,4-DNT難以通過(guò)好氧降解[3]。研究發(fā)現(xiàn)，二硝基甲苯的硝基可以先在厭氧環(huán)境下被微生物還原轉(zhuǎn)化為氨基，以消去硝基的吸電子能力，從而使得還原產(chǎn)物二氨基甲苯在好氧條件下較容易被降解[4-5]。此外，海洋沉積物被認(rèn)為是人類活動(dòng)產(chǎn)生的大量污染物的匯，包括2,4-DNT污染[6]。研究表明，海洋沉積物中的希瓦氏菌屬(Shewanellaspp.)在2,4-DNT污染的原位修復(fù)中起關(guān)鍵作用[7]。根據(jù)其16S rRNA基因序列，希瓦氏菌種可分為兩大類。第1類希瓦氏菌是從海洋環(huán)境中分離得到的，為專性海洋菌，與分離自淡水環(huán)境中的第2類希瓦氏菌相比，其更耐鹽分[8]。因此，研究專性海洋希瓦氏菌在較高鹽度下還原轉(zhuǎn)化2,4-DNT，有助于高鹽度污水中的硝基芳香化合物的修復(fù)。

S.marisflaviEP1菌株為專性海洋菌，分離自廈門近海沉積物[7]，具有厭氧還原轉(zhuǎn)化2,4-DNT的能力[8]。本文將在高鹽度條件下采用EP1對(duì)2,4-DNT的呼吸還原能力進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)一步對(duì)EP1的基因組進(jìn)行測(cè)序和分析，以獲得其呼吸還原2,4-DNT和耐鹽性的相關(guān)遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑有2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT，純度≥ 99%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)、2,4-二氨基甲苯(2,4-DAT，純度≥ 98%，購(gòu)自Aladdin公司)。用于高效液相色譜分析的試劑均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；其他試劑均為分析純或更高純度，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件

EP1菌株分離自海洋沉積物，存于中國(guó)典型菌物保藏中心(編號(hào)：CCTCC M 209016)。采用文獻(xiàn)[8]中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)整至pH=7.0，用高純氮?dú)?99.999%)吹掃10 min，以除去微量的溶解氧，封裝于50 mL血清瓶中，于121 ℃高溫滅菌20 min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中乳酸鈉始終作為電子供體。在含有20 mmol/L乳酸鈉和40 mmol/L富馬酸鈉的厭氧培養(yǎng)基中，接種體預(yù)培養(yǎng)EP1 12 h后，取菌液8 000 ×g離心10 min，收集細(xì)胞，重懸于無(wú)菌BM中作為反應(yīng)接種體。

1.3 高鹽度下呼吸還原2,4-DNT

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用嚴(yán)格的厭氧操作[9-10]。將EP1的預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞接種到含有50 mL無(wú)氧BM的血清瓶中，分別加入10 mmol/L乳酸鈉和100 μmol/L 2,4-DNT作為電子供體和電子受體。細(xì)胞的初始濃度約為2.0×105CFU/mL。通過(guò)添加濃度為0～10%的NaCl來(lái)控制培養(yǎng)基的鹽度。所有反應(yīng)體系均置于黑暗中30 ℃下靜態(tài)培養(yǎng)。為測(cè)定反應(yīng)，使用無(wú)菌注射器從血清瓶中取出1 mL試樣，離心(10 000×g，2 min)后，取上清液分析。

1.4 全基因組測(cè)序

采用MO BIO公司的UltraCleanTM土壤DNA提取試劑盒提取并純化EP1基因組DNA?；蚪M測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥公司完成，測(cè)序文庫(kù)采用SMRTbellTM模板制備試劑盒(Pacific Biosciences of California, USA)構(gòu)建。使用PacBio RS II單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序平臺(tái)聯(lián)合Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)EP1基因組進(jìn)行測(cè)序，且Illumina數(shù)據(jù)用于評(píng)估基因組的復(fù)雜性。EP1基因組序列已上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為CP022272。

1.5 生物信息學(xué)分析

高通量測(cè)序讀長(zhǎng)采用PacBio SMRT portal版本2.3.0中的Hierarchical Genome Assembly Process 3(HGAP3)進(jìn)行組裝。用Quiver算法對(duì)裝配進(jìn)行校正，以獲得高精度的基因組裝配[11]。

采用Circos (v0.64)處理已圖形化的環(huán)狀基因組圖譜[11]。一般基因組注釋使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAP)2.10版本[12]?？焖俟δ茏⑨尣捎肦apid Annotation using Subsystem Technology(RAST)3.0版本以及Clusters of Orthologus Groups (COGs)[13]。

1.6 分析方法

使用配備C18色譜柱(Sun Fire，5 μm，φ4.6 mm×250 mm)的高效液相色譜(Waters e2695)測(cè)定2,4-DNT，流動(dòng)相由水-甲醇組成。其程序如下：0 min時(shí)50%甲醇(V/V)，11 min時(shí)70%甲醇(V/V)，11～13 min時(shí)50%甲醇(V/V)。測(cè)定2,4-DAT，使用乙腈-磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH=7.0，30/70，V/V)為洗脫液，流速1.0 mL/min。所有分析均在室溫下進(jìn)行，進(jìn)樣量為10 μL。使用菌落形成單位(CFU)測(cè)定細(xì)胞密度，將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖液(pH=7)中稀釋，然后1式3份將100 μL等份試樣涂布在Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上，于30 ℃培養(yǎng)24 h后，選取菌落個(gè)數(shù)為30～300的平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高鹽度下2,4-DNT的厭氧呼吸

不同鹽度下菌株EP1對(duì)2,4-DNT的還原轉(zhuǎn)化如圖1所示。圖1中，10 mmol/L乳酸鈉和100 μmol/L 2,4-DNT分別作為電子供體和電子受體，百分?jǐn)?shù)表示NaCl濃度，誤差棒為3次平行的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖1 不同鹽度下菌株EP1對(duì)2,4-DNT的還原轉(zhuǎn)化

由圖1可知，在非鹽條件下觀察不到2，4-DNT的轉(zhuǎn)化。這與EP1屬于專性海洋希瓦氏菌的事實(shí)相符，該類菌需要Na+才能生長(zhǎng)[6]。轉(zhuǎn)化還原速率最大值出現(xiàn)在2%～4% NaCl濃度下，2,4-DNT在12 h內(nèi)幾乎完全還原。在8%的鹽度下，菌株EP1在60 h內(nèi)還原轉(zhuǎn)化約70%的2,4-DNT；在10%的鹽度下，菌株EP1在60 h內(nèi)還原轉(zhuǎn)化約20%的2,4-DNT。

采用2,4-DNT上的硝基與細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)性來(lái)考察EP1在8% NaCl高鹽度下呼吸還原2,4-DNT的情況。8%鹽度下硝基呼吸還原和細(xì)胞生長(zhǎng)耦合情況如圖2所示。圖2中，硝基濃度由1 mol 2,4-DNT含2 mol 硝基計(jì)算。由圖2可知，伴隨硝基的還原，細(xì)胞密度增加了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，最大達(dá)到4.1×107CFU/mL。在無(wú)2,4-DNT作為電子受體的空白對(duì)照中沒(méi)有觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，細(xì)胞生長(zhǎng)與硝基還原同時(shí)發(fā)生，并隨著硝基耗盡而停止。

圖2 8%鹽度下硝基呼吸還原和細(xì)胞生長(zhǎng)耦合情況

EP1菌株在含鹽環(huán)境中顯示出較強(qiáng)的DNT轉(zhuǎn)化能力，特別是與2種非專性海洋希瓦氏菌相比，S.putrefaciensCN32和S.oneidensisMR-1的最適生長(zhǎng)僅發(fā)生在鹽度為0%時(shí)[5]。鹽度偏好表明，EP1為專性海洋菌，且更耐高鹽度。研究還發(fā)現(xiàn)，EP1可在高達(dá)20%的高NaCl濃度下對(duì)染料Xylidine Ponceau 2R還原脫色[13]。 為深入了解厭氧呼吸遺傳基礎(chǔ)并探索鹽分耐受性的潛在應(yīng)用，對(duì)EP1全基因組序列進(jìn)行測(cè)定，并開(kāi)展生物信息學(xué)分析。

2.2 全基因組測(cè)序

目前，希瓦氏菌S.marisflavi種內(nèi)還沒(méi)有獲得任何菌株的基因組序列。因此，對(duì)菌株S.marisflaviEP1的全基因組進(jìn)行測(cè)序，以期獲得對(duì)遺傳性狀的更多了解。高通量測(cè)序共產(chǎn)生了52 966個(gè)高質(zhì)量讀長(zhǎng)，平均讀長(zhǎng)7 518 bp。使用分層基因組組裝技術(shù)從頭開(kāi)始重新組裝讀長(zhǎng)，以生成僅含1個(gè)大重疊群(contig)的完整基因組。

S.marisflaviEP1基因組的一般特征見(jiàn)表1，S.marisflaviEP1的環(huán)狀基因組圖如圖3所示。圖3中，從外到內(nèi)：環(huán)(1)顯示了以Mbps為單位的刻度線；環(huán)(2)和環(huán)(3)顯示了+和-鏈上的預(yù)測(cè)編碼基因，并通過(guò)不同的COG功能分類進(jìn)行著色；環(huán)(4)代表tRNA(紅色)和rRNA(藍(lán)色)；環(huán)(5)和環(huán)(6)分別表示G+C含量和G+C偏移。由表1和圖3可知，EP1的基因組為4 321 452 bp的環(huán)狀染色體，G-C含量為50.0%。通過(guò)PGAP分析注釋，染色體上總共預(yù)測(cè)了3 661個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，25個(gè)rRNA和98個(gè)tRNA(見(jiàn)表1)。此外，根據(jù)COGs數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組功能注釋和分類，共有3 364個(gè)基因被劃分為22個(gè)不同的功能類別，包括能量產(chǎn)生和保存、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等(見(jiàn)圖3(b))。

表1 S. marisflavi EP1基因組的一般特征

(a) S. marisflavi EP1的環(huán)狀基因組圖

(b) EP1基因組在COGs數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋

2.3 與2,4-DNT呼吸和耐鹽性相關(guān)的基因

S.marisflaviEP1對(duì)2,4-DNT的還原轉(zhuǎn)換能力可能是細(xì)胞內(nèi)多種電子傳遞系統(tǒng)蛋白共同作用的結(jié)果，尤其是c型細(xì)胞色素蛋白可能在2,4-DNT呼吸還原中起到重要作用[14]?；蚪M分析表明，EP1共有多達(dá)41種推定的c型細(xì)胞色素，包括10種10-血紅素細(xì)胞色素c和1種定位表面的非10-血紅素細(xì)胞色素c脂蛋白。與其他希瓦氏菌類似，EP1具有1個(gè)編碼c型細(xì)胞色素的基因座。這些色素構(gòu)成Mtr電子的傳遞途徑[15]。希瓦氏菌中編碼胞外電子傳遞系統(tǒng)基因座對(duì)比如圖4所示。由圖4可知，EP1基因座中的基因排列與S.pealeana和S.halifaxensis最為相似。

圖4 希瓦氏菌中編碼胞外電子傳遞系統(tǒng)基因座對(duì)比

對(duì)于希瓦氏菌屬，Mtr呼吸途徑被認(rèn)為是硝基化合物厭氧呼吸中必不可少的胞外電子轉(zhuǎn)移途徑[16-17]。4種血紅素c型細(xì)胞色素(包括MtrA，MtrB，MtrC和OmcA)是Mtr呼吸途徑的主要成分，均參與DNT呼吸還原。然而，敲除Mtr途徑并沒(méi)有導(dǎo)致DNT生物還原能力完全喪失。這表明除Mtr途徑之外的其他c型細(xì)胞色素可能也參與了DNT的還原[17]。這些結(jié)果與EP1的基因組分析結(jié)論一致，即除了Mtr途徑外，大約還有30種推定的c型細(xì)胞色素由EP1基因組編碼。c型細(xì)胞色素的多樣性表明希瓦氏菌中電子傳遞至DNT的機(jī)理比預(yù)期的更復(fù)雜。

S.marisflaviEP1基因組中耐鹽性相關(guān)基因見(jiàn)表2。由表2可知，EP1基因組包含多個(gè)鹽度耐受相關(guān)基因。編碼陽(yáng)離子/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白nha的基因使得細(xì)菌具有對(duì)高Na+濃度和高堿性的耐受性[18-19]。yggT基因編碼蛋白賦予細(xì)菌細(xì)胞對(duì)滲透休克的耐受性[19]。kef基因編碼的陽(yáng)離子特異性通道蛋白參與滲透壓適應(yīng)性[20-21]。trk基因也被發(fā)現(xiàn)存在于染色體上，其有助于Na+的胞外輸出，并提高細(xì)胞抗鹽能力[22]。

3 結(jié)論

EP1具有出色的2,4-DNT還原性能和耐鹽性，在含8%～10%NaCl的高鹽度下能有效地進(jìn)行2,4-DNT的生物轉(zhuǎn)化。菌株EP1的基因組為環(huán)狀染色體，總長(zhǎng)為4 321 452 bp，G-C含量為50%，包含3 661個(gè)編碼基因?；蚪M注釋發(fā)現(xiàn)包括Mtr呼吸途徑在內(nèi)的共41種c型細(xì)胞色素負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移和硝基呼吸還原，多個(gè)耐鹽性相關(guān)的基因也在EP1基因組中被識(shí)別。高鹽度下EP1呼吸還原2,4-DNT的性能及其遺傳特征會(huì)加深對(duì)環(huán)境中硝基芳香族化合物轉(zhuǎn)化和歸趨的理解，同時(shí)還可為硝基芳香族化合物環(huán)境污染修復(fù)研究積累基礎(chǔ)。