閔建華，陳世乾，陳 婷

(1.湖北理工學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435003；2.湖北師范大學(xué)，湖北 黃石 435002)

哈密瓜因汁多肉厚、香甜可口、營(yíng)養(yǎng)豐富，在夏秋季節(jié)深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，是消暑降溫、解渴生津的家庭必備瓜果之一，被譽(yù)為“天下第一瓜”[1]。但因其體積較大、含糖量較高，在貯存期，特別是夏季多雨、悶熱潮濕的環(huán)境中[2]，極易染上霜霉病、葉斑病、蔓枯病等病害，造成經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前，常用的食品貯藏保鮮方法主要有低溫貯藏、氣調(diào)保鮮、殺菌劑滅菌、保鮮膜包裝等[2-3]。本研究將分離并鑒定引起哈密瓜病害的主要病原菌，并采用氣調(diào)、殺菌劑滅菌等食品技術(shù)手段進(jìn)行保鮮處理，以抑制病原菌的生長(zhǎng)，阻止哈密瓜腐爛，達(dá)到延長(zhǎng)貯藏期的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用哈密瓜市購(gòu)，帶梗，大小均勻一致，無(wú)損傷，約3.0 kg/個(gè)。

1.2 試劑與設(shè)備

1)試驗(yàn)用瓊脂粉、噻苯咪唑(TBZ)、殼聚糖為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。

2)試驗(yàn)用儀器包括：MJX-280H型智能霉菌培養(yǎng)箱；S.SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái)；LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器；BY-TR型光學(xué)顯微鏡；XY-3A型臭氧發(fā)生器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基的制備

將馬鈴薯洗凈、切片、烘干，制成馬鈴薯粉。取100 g馬鈴薯粉，加入500 mL去離子水，煮沸40 min，加入10 g葡萄糖粉和20 g瓊脂粉，補(bǔ)水至500 mL，用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌，待用[4-5]。

1.3.2病原菌的分離、純化和鑒定

取3個(gè)出現(xiàn)病變的哈密瓜，先用75%醫(yī)用酒精對(duì)病變表面及周圍進(jìn)行擦洗消毒，然后用無(wú)菌水沖洗整個(gè)表皮數(shù)遍，用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)哈密瓜病變區(qū)。在健康果肉與病變區(qū)接觸處，用無(wú)菌鑷子夾取病變組織，均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行接種[5]。每個(gè)瓜取3個(gè)病變組織，呈三角形接種于同一培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d[6]，觀察菌落狀態(tài)，選取具有代表性的菌落，重新接種于新的培養(yǎng)基平板上，以此類推，直至選出大小形狀顏色一致的菌落[5,7]。取1滴乳酸苯酚棉藍(lán)染液于載玻片上，用接種針挑取少許純化后的菌絲置于染液中并分散開(kāi)，在顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)特征[8]，參照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。

1.3.3回接試驗(yàn)

取病原菌孢子，制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。取新鮮哈密瓜，表面用75%醫(yī)用酒精進(jìn)行消毒，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍，晾干[9]。取20 μL孢子懸浮液于無(wú)菌橡膠蓋內(nèi)。將橡膠蓋倒扣在哈密瓜果皮上并固定，在果皮表面均勻選取10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行相同操作[10-11]。將哈密瓜放于培養(yǎng)箱中，保持一定濕度和溫度(室溫)，觀察發(fā)病情況，并進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.4病原菌抑制試驗(yàn)

1)將無(wú)菌殼聚糖溶液加入培養(yǎng)基中，制成殼聚糖濃度為1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mg/mL的培養(yǎng)基，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)[12]。

2)將接種有病原菌的平板置于臭氧環(huán)境中，臭氧濃度分別為300，400，500，600和700 μg/L，培養(yǎng)病原菌，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)[13-14]。

3)在密閉環(huán)境中，采用5%TBZ對(duì)接種有病原菌的平板進(jìn)行熏蒸，5%TBZ的用量分別為4，5，6，7和8 g/m3，培養(yǎng)病原菌，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)[15-16]。

4)設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)表1中的因素和水平，在殼聚糖培養(yǎng)基平板上定量接種病原菌。將平板置于PE袋內(nèi)，每天用TBZ熏蒸1次，每次持續(xù)90 min[15]；然后用臭氧發(fā)生器向PE袋內(nèi)充入一定濃度的臭氧，每隔6 h檢查臭氧濃度，保持臭氧濃度恒定[14,17]，如此處理5 d后，計(jì)算產(chǎn)生的孢子數(shù)量。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[18]。

孢子繁殖抑制率η計(jì)算公式[12，19-20]為：

η=(N1-N2)/N1×100%

(1)

式(1)中，N1為對(duì)照組孢子數(shù)量；N2為處理組孢子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1哈密瓜發(fā)病狀態(tài)

病原菌主要從機(jī)械損傷處或皮孔進(jìn)入哈密瓜組織[21]。發(fā)病初期，表皮處主要出現(xiàn)不同程度的潮濕和不同顏色斑點(diǎn)。隨著時(shí)間推移，斑點(diǎn)會(huì)慢慢向組織內(nèi)部發(fā)展，使哈密瓜腐爛。在較高溫度下，腐爛會(huì)加快[22]。進(jìn)一步觀察可發(fā)現(xiàn)，腐爛組織表面會(huì)出現(xiàn)白霉和白色、淺藍(lán)色孢子。

2.1.2病原菌鑒定

將分離純化后的病原菌在馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)。病原菌菌落和孢子如圖1所示。由圖1可知，病原菌菌落表面為黃綠色或淺褐色，背面為黃色或褐色，呈粒狀形態(tài)、較厚。病原菌分生孢子梗呈帚狀，含3層間枝，直徑為3.5～4.5 μm。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》，認(rèn)定哈密瓜病原菌為青霉屬鮮綠青霉[5]。

(a) 菌落特征

圖1 病原菌菌落和孢子

2.1.3回接試驗(yàn)結(jié)果

取病原菌對(duì)哈密瓜進(jìn)行接種，培養(yǎng)3 d后，哈密瓜發(fā)病率為35%，對(duì)照組無(wú)發(fā)病現(xiàn)象。取哈密瓜的發(fā)病組織進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)出現(xiàn)的致病菌分離純化，進(jìn)行回接試驗(yàn)[11]，發(fā)現(xiàn)哈密瓜發(fā)病區(qū)表現(xiàn)出相似的癥狀，證明鮮綠青霉為哈密瓜的貯期病變的主要致病菌。

2.2 病原菌抑制試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1殼聚糖對(duì)孢子的抑制作用

殼聚糖濃度對(duì)孢子的抑制作用曲線如圖2所示，將對(duì)照組的抑制率定義為0(下文同)。由圖2可知，隨著殼聚糖濃度升高，殼聚糖對(duì)哈密瓜病原菌的抑制率升高，當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，其對(duì)病原菌的抑制作用趨于平衡。因此，確定3 mg/mL為抑制哈密瓜病原菌孢子繁殖的理想殼聚糖濃度。

圖2 殼聚糖濃度對(duì)孢子的抑制作用曲線

2.2.2臭氧對(duì)孢子的抑制作用

臭氧濃度對(duì)孢子的抑制作用曲線如圖3所示。由圖3可知，隨著臭氧濃度增加，病原菌孢子的萌發(fā)延遲，說(shuō)明臭氧具有抑制病原菌孢子繁殖的作用。進(jìn)一步觀察可知，在臭氧濃度為300～700 μg/L時(shí)，臭氧濃度越大，對(duì)孢子的抑制效果越好；當(dāng)臭氧濃度達(dá)到600 μg/L時(shí)，其對(duì)病原菌的抑制作用趨于平衡。因此，確定600 μg/L為抑制病原菌孢子繁殖的理想臭氧濃度。

圖3 臭氧濃度對(duì)孢子的抑制作用曲線

2.2.3 5%TBZ熏蒸對(duì)孢子的抑制作用

5%TBZ用量對(duì)孢子的抑制作用曲線如圖4所示。由圖4可知，隨著5%TBZ用量增加，病原菌孢子的萌發(fā)延遲，說(shuō)明TBZ具有抑制病原菌孢子繁殖的作用。進(jìn)一步觀察可知，5%TBZ用量為4～8 g /m3時(shí)，5%TBZ用量越大，對(duì)孢子的抑制效果越好；當(dāng)5%TBZ用量達(dá)到6 g/m3時(shí)，其對(duì)病原菌的抑制作用趨于平衡。因此，確定6 g/m3為抑制病原菌孢子繁殖的理想5%TBZ用量。

圖4 5%TBZ用量對(duì)孢子的抑制作用曲線

2.2.4殼聚糖、臭氧、TBZ復(fù)合處理對(duì)孢子的抑制作用

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。由表2可知，對(duì)孢子生長(zhǎng)繁殖起抑制作用的主次順序?yàn)椋?%TBZ用量>殼聚糖濃度>臭氧濃度；最優(yōu)處理?xiàng)l件為：殼聚糖濃度為3 mg/mL、O3濃度為600 μg/L、5%TBZ用量為6 g/m3。在此復(fù)合條件處理下，對(duì)孢子繁殖的抑制效果最好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.5作用機(jī)理分析

TBZ是一種低毒性的殺菌劑，具有良好的殺菌效果，被廣泛用于瓜果蔬菜的貯藏保鮮[23]。TBZ能夠抑制子囊菌、擔(dān)子菌等真菌的活性，對(duì)果品蔬菜真菌病害的防治具有很好的效果[24]。殼聚糖作為一種天然的高分子聚合物，具有來(lái)源廣泛、制備簡(jiǎn)便、安全可靠的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[25]。殼聚糖及其衍生物對(duì)食品防腐保鮮的作用機(jī)理主要表現(xiàn)在以下2個(gè)方面[26]：①小分子量的殼聚糖及其衍生物通過(guò)正負(fù)電荷相吸作用，改變微生物內(nèi)外環(huán)境的滲透壓，從而導(dǎo)致微生物死亡，或者直接進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部，與其核酸或蛋白結(jié)合，從而影響微生物的生理功能，導(dǎo)致微生物的死亡；②高分子的殼聚糖及其衍生物附著在微生物表面，形成一種高分子膜，阻止養(yǎng)分或O2進(jìn)入微生物內(nèi)部，導(dǎo)致微生物死亡。臭氧具有強(qiáng)氧化性，性質(zhì)活潑，可通過(guò)強(qiáng)氧化作用破壞微生物細(xì)胞膜，改變微生物細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，達(dá)到殺菌的效果[27]。

3 結(jié)論

本文對(duì)引起哈密瓜貯期主要病害的病原菌進(jìn)行了分離純化，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了殼聚糖涂抹、臭氧殺菌、5%TBZ熏蒸等方式對(duì)哈密瓜貯藏期孢子繁殖的抑制作用，得到抑制孢子繁殖的主次順序?yàn)椋?%TBZ用量>殼聚糖濃度>臭氧濃度；最優(yōu)組合處理?xiàng)l件為：殼聚糖濃度為3 mg/mL、臭氧濃度為600 μg/L、5%TBZ用量為6 g/m3。