曹守瑩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

0 引言

線粒體是真核細(xì)胞中的主要細(xì)胞器之一，細(xì)胞內(nèi)多種代謝活動均與線粒體相關(guān)，如糖代謝、脂代謝以及生物氧化過程。真核細(xì)胞中的能源物質(zhì)ATP的生成也主要在線粒體里進(jìn)行，ATP產(chǎn)生后可以為各種生命活動提供大部分的能量[1]。作為半自主細(xì)胞器，線粒體具有自身特有的蛋白質(zhì)合成機(jī)制和自主復(fù)制的線粒體DNA。研究表明，線粒體DNA屬于共價閉合環(huán)狀分子，與真核生物基因組DNA相比，線粒體DNA具有更高的遺傳突變率,原因在于其為無組蛋白保護(hù)的裸露DNA且線粒體中缺乏DNA損傷修復(fù)體系[2]。近30年來的研究證實，有多達(dá)上百種人類疾病的發(fā)生發(fā)展與線粒體突變密切相關(guān)，從而使得對線粒體的研究受到越來越多的科研人員的重視，興起的線粒體生物醫(yī)學(xué)研究熱潮一直持續(xù)到現(xiàn)在[3]。

線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，參與多種生物反應(yīng)過程與細(xì)胞凋亡，如生物氧化過程中呼吸鏈過度產(chǎn)生及釋放氧自由基 (reactive oxygen species, ROS)，線粒體膜的通透性發(fā)生改變(如通透性轉(zhuǎn)運孔異常開放),線粒體跨膜電位水平變化，Ca2+外流,細(xì)胞色素C(Cytochrome C)釋放到胞漿等[4]。隨著對線粒體功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤藥物的作用靶點位于線粒體的膜結(jié)構(gòu)或線粒體中的組成呼吸鏈酶復(fù)合物上，藥物主要通過影響細(xì)胞線粒體呼吸鏈相關(guān)酶的活性，繼而改變細(xì)胞膜的通透性來發(fā)生作用[5]。

在眾多靶向線粒體抗腫瘤藥物中，氮芥和氮唑類化合物得到了人們的廣泛關(guān)注。氮芥是一類含有β-氯乙胺結(jié)構(gòu)的化合物，具有抗瘤譜廣、療效顯著、合成簡便及成本低廉等諸多優(yōu)點，在多種惡性腫瘤的臨床治療中扮演著重要角色[6]。氮唑類化合物的合成和應(yīng)用也是目前化學(xué)藥物合成領(lǐng)域的一個熱點，其中1,2,3-三唑是1,2,4-三唑的生物電子等排體，常存在于臨床常用的一些抗感染藥物中[7]。

本研究設(shè)計并合成了一種新型吡啶氮唑氮芥化合物N,N'-(1,1'-(吡啶-2,6-二取代雙(亞甲基))雙(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))雙(亞甲基)雙(2-氯-N-(2-氯乙基)乙胺)，采用1H NMR和13C NMR現(xiàn)代波譜手段確證了新化合物的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用MTT試劑盒檢測了該新型吡啶氮唑氮芥化合物對癌細(xì)胞系A(chǔ)549的抑制活性，探究了該化合物的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

1)主要試劑： RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基；南美胎牛血清；青霉素-鏈霉素溶液(100X)；胰酶細(xì)胞消化液(0.25%胰酶)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒；活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)；磷酸緩沖鹽溶液PBS；兔抗Bax抗體；兔抗Bcl-2抗體；兔抗GAPDH抗體；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒。

2)主要儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA cell150i，Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Axiovert 40,德國Zeiss公司)；流式細(xì)胞儀(FACS Calibur,Becton Dickinson and Company)；酶標(biāo)儀(Epoch2，BioTek)；Western電泳儀(PowerPac系列,Bio-Rad)；轉(zhuǎn)膜儀(Trans-Blot Turbo,Bio-Rad)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肺上皮細(xì)胞永久細(xì)胞株(A549)(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素)、37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次，每次按照1∶3的比例胰酶消化、傳代[8]。

1.3 實驗方法

1.3.1氮唑氮芥類化合物的合成

1)中間體2,6-二疊氮甲基吡啶的合成。室溫攪拌下向2,6-二氯甲基吡啶(1.76 g,10 mmol)和丙酮水溶液(20 mL,1∶1,V丙酮∶V水)混合物中加入過量的疊氮化鈉(1.43 g,22 mmol)，加熱，使混合反應(yīng)物升溫至50 ℃，過夜反應(yīng)。反應(yīng)液減壓蒸餾去除溶劑，將殘留物用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到無色液體。需注意的是，減壓去除溶劑時疊氮化合物絕不能蒸干。

2)中間體N,N-二(2-氯乙基)-2-丙炔-1-胺的合成。在15 mL丙酮、二(2-氯乙基)胺(1.95 g,10 mmol)和碳酸鉀(1.6 g,11.5 mmol)的混合溶液里，室溫攪拌下加入3-溴-1-丙炔(1.9 mL,25 mmol)。反應(yīng)1 h后，加入四丁基碘化銨(5.0 mg)，繼續(xù)升溫至40 ℃，反應(yīng)10～12 h。旋蒸去除溶劑，再加入30 mL水，用氯仿萃取3次。有機(jī)層用Na2SO4干燥，減壓蒸餾去氯仿得到黃色液體粗品。

3)目標(biāo)化合物N,N'-(1,1'-(吡啶-2,6-二取代雙(亞甲基))雙(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))雙(亞甲基)雙(2-氯-N-(2-氯乙基)乙胺)的合成。在N,N-二(2-氯乙基)-2-丙炔-1-胺(1.8 g,10 mmol)和t-BuOH/H2O的混合液(15 mL,1∶1,V∶V)中，加入2,6-二疊氮甲基吡啶(0.76 g,4 mmol)，再加入抗壞血酸鈉(0.2 equiv)和五水硫酸銅(0.1 equiv)。將反應(yīng)物溶液加熱到50 ℃并進(jìn)行攪拌。TLC檢測原料點消失后，減壓去除溶劑，殘余物倒入水中，然后用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到粗品。殘余物經(jīng)硅膠柱色譜(展開劑為V氯仿∶V甲醇，5∶1)分離，得到目標(biāo)產(chǎn)物棕色液體，收率為46%。1H NMR (CDCl3,300 MHz) δ:7.74(s,1H,triazole 5-H)，7.61～7.56(t,1H,J=15 Hz,Py 4-H),7.41～7.43(d,2H,J=9.0 Hz,Py 3-H,5-H),5.58(s,4H,Py CH2N),3.75(s,4H,CH2N),2.93～2.97(t,8H,J=12 Hz,NCH2);13C NMR(CDCl3,75 MHz) δ:158.2(pyridine 2-C),137.5(thienyl 4-C),121.0(thienyl 3-C),60.1(pyridine-CH2),56.3(NCH2),42.1(CH2Cl)ppm。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(即細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶/皿底為70%～80%)，使用血球計數(shù)板計數(shù)，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，按照100 μL/孔的量將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放在CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，用微量移液器吸去每孔中的上清，1×PBS清洗細(xì)胞3次，向孔板中分別加入濃度為0，0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL的新型吡啶氮唑氮芥化合物溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，向每孔中均加入濃度為5 mg/mL 的MTT 試劑10 μL，放置于CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。離心10 min(1 000 r/min)，棄上清，按照100 μL/孔的量向96孔板中加入DMSO，置于水平搖床中震蕩10 min，最后在酶標(biāo)儀上使用490 nm波長測各孔的吸光度。每個濃度組均設(shè)6個復(fù)孔。根據(jù)試劑盒說明書上的公式計算細(xì)胞相對存活率。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測AnnexinV-FITC/PI雙染后的細(xì)胞凋亡情況

取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，使用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105個/mL，按照2 mL/孔的量將細(xì)胞接種于6孔板，并置于CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁長至70%～80%時，棄去上清，1×PBS洗細(xì)胞3次，分別向各孔中加入2 mL濃度為0，3.25 μg/mL的新型吡啶氮唑氮芥化合物溶液。置于37 ℃，CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，使用0.25%的胰酶消化細(xì)胞、800 g離心5 min后進(jìn)行細(xì)胞收集。根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)雙染等實驗操作，染色后的細(xì)胞使用300目濾網(wǎng)過濾后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，觀察不同組細(xì)胞的凋亡情況及變化趨勢。每個實驗組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.4使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的水平

A549細(xì)胞的培養(yǎng)以及6孔板種板、各個實驗組的設(shè)置、新型吡啶氮唑氮芥化合物的濃度設(shè)置等與1.3.3相同。對照組及染毒組的細(xì)胞均用1×PBS緩沖液進(jìn)行漂洗，800 g離心5 min后收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于稀釋好的DCFH-DA(RPMI-1640無血清培養(yǎng)液稀釋至10 μmol/L)中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸[9]。使用RPMI-1640培養(yǎng)液(不加血清)洗滌細(xì)胞并離心，重復(fù)3次，1×PBS緩沖液重懸細(xì)胞并用300目濾網(wǎng)過濾后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，每個實驗組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.5使用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位

A549細(xì)胞的培養(yǎng)以及6孔板種板、各個實驗組的設(shè)置、新型吡啶氮唑氮芥化合物的濃度設(shè)置等與1.3.3相同。1×PBS洗滌細(xì)胞3次后離心5 min(1 000 r/min)，收集各實驗組細(xì)胞。根據(jù)線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書配置JC-1工作液。將細(xì)胞重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后加入0.5 mL JC-1工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃下孵育20 min。細(xì)胞經(jīng)JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌并重懸后，用300目濾網(wǎng)過濾，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，每個實驗組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.6蛋白質(zhì)印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

A549細(xì)胞的培養(yǎng)以及6孔板種板、各個實驗組的設(shè)置、新型吡啶氮唑氮芥化合物的濃度設(shè)置等與1.3.3相同。待細(xì)胞貼壁生長至70%～80%，棄上清，1×PBS緩沖液洗3次，分別向6孔板各孔中加入2 mL濃度為0，3.25μg/mL的新型吡啶氮唑氮芥化合物。37 ℃下CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，800 g離心5 min后進(jìn)行細(xì)胞收集；RIPA+PMSF(100∶1)裂解細(xì)胞、提取蛋白、使用BCA法定量后調(diào)至各組蛋白濃度一致。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的一系列實驗操作(電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉)，將有相應(yīng)蛋白條帶的PVDF膜剪下，加入對應(yīng)的稀釋抗體后，置于4 ℃搖床上孵育過夜，其中兔抗Bax抗體及兔抗Bcl-2抗體的稀釋比均為1∶500，內(nèi)參兔抗GAPDH抗體的稀釋比為1∶1 000；用1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，加辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h；TBST洗3次，每次10 min， ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Tanon MP蛋白成像系統(tǒng)成像，用Image J軟件分析各組蛋白條帶對應(yīng)的灰度值。每個實驗組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.4 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),統(tǒng)計結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 新型吡啶氮唑氮芥化合物對細(xì)胞存活率的影響

不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率如圖1所示。由圖1可知，與對照組(0 μg/mL)相比，細(xì)胞存活率隨著新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒濃度增加均呈梯隊下降的態(tài)勢，并且這種態(tài)勢具有時間-濃度依賴性。濃度為0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL的新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒24 h后，細(xì)胞存活率分別為94.51%，81.57%，57.29%，46.34%。新型吡啶氮唑氮芥化合物對A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.25 μg/mL，采取3.25 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率

2.2 新型吡啶氮唑氮芥化合物對A549細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測不同組A549細(xì)胞的凋亡情況，不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡流式分析圖如圖2所示。由圖2可知，新型吡啶氮唑氮芥化合物以0 μg/mL及3.25 μg/mL的濃度作用A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為4.1%，11.93%。與對照組相比，實驗組的細(xì)胞凋亡率呈明顯上升趨勢，且早期凋亡率與晚期凋亡率均上升。細(xì)胞碎片比率也隨之增加，從對照組的5.13%升高到實驗組的14.7%。

(a) 0 μg/mL

圖2 不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡流式分析圖

2.3 A549細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平檢測結(jié)果

使用本身無熒光的DCFH-DA染料進(jìn)行ROS水平檢測。這種染料具有細(xì)胞膜滲透性，能夠自由穿過細(xì)胞膜。染料進(jìn)入細(xì)胞后首先被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2',7'-二氯二氫熒光素(DCFH)，然后進(jìn)一步被ROS氧化而生成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)2',7'-二氯熒光素(DCF)。通過檢測終產(chǎn)物DCF的吸光度水平來反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平的高低， DCF的熒光光譜和FITC非常相似，流式檢測時用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平如圖3所示。由圖3可知，與對照組相比，實驗組的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨著新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒濃度的增加呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

(a) 0 μg/mL

圖3 不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.4 A549細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位檢測結(jié)果

使用JC-1熒光探針進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。這種熒光探針能夠選擇性地進(jìn)入到線粒體內(nèi)，并且隨著線粒體膜電位降低發(fā)生從橙色(JC-1聚合體)到綠色(JC-1單體)的可逆性變化，這一變化能夠被流式細(xì)胞儀檢測并分析。不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后線粒體膜電位水平變化如圖4所示。由圖4可知，與對照組相比，實驗組的綠色熒光(JC-1單體)與橙色熒光(JC-1聚合體)強(qiáng)度的比值明顯升高，表明A549細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨著新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒濃度的增加呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

(a) 0 μg/mL

圖4 不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后線粒體膜電位水平變化

2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測技術(shù)檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)結(jié)果

使用蛋白質(zhì)印跡檢測技術(shù)(Western Blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)，不同濃度新型吡啶氮唑氮芥化合物染毒A549細(xì)胞24 h后，WB檢測Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5所示。

(a) 對照組 (b) 實驗組

由圖5可知，與對照組相比，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯降低，而凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)水平則明顯升高，進(jìn)一步在蛋白層面證明了此新型吡啶氮唑氮芥化合物具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

3 結(jié)論

1)施加新型吡啶氮唑氮芥化合物可導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平上調(diào)，線粒體膜電位降低，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2)線粒體凋亡途徑在新型吡啶氮唑氮芥化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，新型吡啶氮唑氮芥化合物通過上調(diào)線粒體凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。