方桂任，劉 輝，林振孟 (福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸腫瘤外科，福建 福州 350014)

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，2018年全球總發(fā)病率約為18萬，死亡人數(shù)約為8萬[1]。盡管當(dāng)前整體治療水平有所提高，但喉癌的總體生存率仍較差。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，揭示喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有利于開發(fā)喉癌新的治療藥物。p62/SQSTM1(以下稱p62)是一種多功能的銜接蛋白，作為自噬的選擇性底物[2]，在胃癌[3]、肝細(xì)胞癌[4]、乳腺癌[5]中均發(fā)現(xiàn)p62的異常積聚，本文探討自噬相關(guān)蛋白p62在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2010年1月～2015年4月于福建省腫瘤醫(yī)院行喉癌手術(shù)患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①根治性手術(shù)；②病理明確為鱗癌；③臨床病理資料完整，隨訪可靠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前新輔助化療；②合并其他部位惡性腫瘤；③術(shù)后30 d內(nèi)死亡。共有115例患者納入研究，采用免疫組化檢測(cè)喉癌組織及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本p62蛋白表達(dá)水平。另一方面，收集2018年1月～2019年8月我院25例新鮮喉癌組織標(biāo)本放入-80℃冰箱保存，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)冷凍保存標(biāo)本中p62mRNA及蛋白的表達(dá)水平。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2主要試劑:p62單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，RNA分離試劑盒Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)所用試劑及蛋白裂解液盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化SP法:將石蠟組織以4 μm厚連續(xù)切片，65℃烤箱烘片30 min，脫蠟、水化、阻斷過氧化物酶活性、修復(fù)抗原，山羊血清封閉液封閉后加入鼠抗人p62一抗，4℃過夜，加入二抗、DAB染色、復(fù)染、脫水后顯微鏡下觀察。染色強(qiáng)度分級(jí):無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%為0分,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75% 為1分,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥76%為2分。兩項(xiàng)得分相加,3～4分為高表達(dá),0～2分為低表達(dá)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)：采用Trizol試劑盒提取并純化新鮮標(biāo)本mRNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，72℃60 s延伸，共40個(gè)循環(huán)。p62上游引物序列：5′- AGCTGCCCTCAGCCCTCTA-3′，下游引物序列:5′- GGCTTCTCTTCCCTCCATGTT-3′。看家基因GAPDH上游引物序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列：5′-TCCACCACCCTGTrGCTGTA-3′。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法：充分研磨并裂解組織，采用BCA法測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加p62單克隆抗體(稀釋比例1∶1 000)4℃孵育過夜，相應(yīng)二抗(稀釋比例1∶000)室溫孵育1 h，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

圖1 p62在喉癌組織中表達(dá)陽(yáng)性(×10)

2.1p62在喉癌組織中的表達(dá)情況:免疫組化中，p62蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，p62在喉癌石蠟組織中表達(dá)陽(yáng)性率為56.5%(65/115)，高于癌旁正常組織的23.5%(27/115)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、圖2。在新鮮冰凍組織中，RT-PCR結(jié)果擴(kuò)增曲線呈S形，溶解曲線呈單峰，說明結(jié)果可靠，見圖3、圖4。p62mRNA在喉癌表達(dá)水平[ΔCT值為(2.814±1.156)]高于癌旁正常組織[ΔCT值為(1.632±1.061)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示：喉癌組織中p62蛋白表達(dá)水平(0.812±0.421)高于癌旁正常組織(0.501±0.311)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖2 p62在癌旁正常組織中表達(dá)陰性(×10)

圖3 p62擴(kuò)增曲線

圖4 p62的溶解曲線

圖5 1-3：喉癌組織，4-6：癌旁正常組織

2.2p62與臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系:p62的表達(dá)與年齡、性別、吸煙、臨床分型、腫瘤大小、分化程度、手術(shù)方式無關(guān)(P>0.05)；與喉癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期有關(guān)(P<0.05)，見表1。p62陽(yáng)性患者的5年生存率為36.1%，低于p62陰性患者的62.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見圖6。

表1 p62與臨床病理特征的關(guān)系

圖6 p62陽(yáng)性和陰性的生存曲線

3 討論

自噬是生物在進(jìn)化中保守的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過程，在這個(gè)過程中，自噬底物(細(xì)胞質(zhì)大分子、聚集蛋白、受損細(xì)胞器或病原體)被運(yùn)送到溶酶體，并被溶酶體水解消化產(chǎn)生核苷酸、氨基酸、脂肪酸、葡萄糖和ATP，最終循環(huán)到細(xì)胞質(zhì)。這種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我消化一方面維持細(xì)胞在饑餓和應(yīng)激期間的新陳代謝和生存，另一方面消除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以保持蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的質(zhì)量和數(shù)量平衡[6]。p62是應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，作為非典型蛋白激酶C(PKC)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 (ERK1)、核因子-JB和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)的支架蛋白已被廣泛研究，越來越多證據(jù)表明，在氧化應(yīng)激反應(yīng)以及泛素化的自噬受體中發(fā)揮著巨大的作用[7]。p62具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括Phox1和Bem1p(PB1)結(jié)構(gòu)域、鋅指(ZZ)、兩個(gè)核定位信號(hào)、一個(gè)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合域、一個(gè)核輸出信號(hào)、一個(gè)LC3相互作用區(qū)(LIR)、一個(gè)Keap1相互作用區(qū)(KIR)和一個(gè)泛素相關(guān)(UBA)結(jié)構(gòu)域,不同的結(jié)構(gòu)域與各個(gè)受體相互結(jié)合從而發(fā)揮多種作用[8]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)在自噬中發(fā)揮多種作用，包括自噬泡膜形成、轉(zhuǎn)運(yùn)自噬底物和自噬小體運(yùn)輸，是自噬體的標(biāo)志性分子[9]。p62中的LIR結(jié)構(gòu)域與LC3上多個(gè)位點(diǎn)相互作用，將泛素化的自噬底物遞送溶酶體中，進(jìn)而與溶酶體結(jié)合，促使底物被選擇性自噬。此外，p62是哺乳動(dòng)物溶酶體激活的信號(hào)樞紐，也是激活自噬底物上Keap1-Nrf2信號(hào)通路樞紐，在選擇性自噬中扮演著特定且不可或缺的角色[10]。

本研究中，p62與喉癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期有關(guān)，其陽(yáng)性預(yù)示著患者的不良預(yù)后，表明p62促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)展。癌細(xì)胞與所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系，稱為腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是近年來出現(xiàn)的新興概念，已成為腫瘤研究的一個(gè)重要標(biāo)志，腫瘤微環(huán)境通過提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使腫瘤細(xì)胞能夠存活，由自噬介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境可能在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥中發(fā)揮重要作用，自噬與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用越來越引起人們的關(guān)注。自噬可以由腫瘤微環(huán)境中的幾種應(yīng)激源誘導(dǎo)，同時(shí)自噬也可以改變腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境的生理特征明顯不同于正常組織，由于腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)，血管生成不足無法輸送充足的氧氣及能量至整個(gè)腫瘤，所以腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)為缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)及能量、酸性和炎性反應(yīng)[11]。越來越多的證據(jù)表明，自噬可以幫助腫瘤細(xì)胞分解大分子物質(zhì)來提供能量，從而適應(yīng)腫瘤細(xì)胞惡劣的微環(huán)境，從而有利于腫瘤細(xì)胞的存活[12]。失巢凋亡是指細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)喪失接觸后誘導(dǎo)的凋亡。癌細(xì)胞可通過血管及淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處組織和器官，在此期間，自噬可使癌細(xì)胞在失去細(xì)胞外基質(zhì)的情況下存活和增殖，避免失巢凋亡[13]。一項(xiàng)研究表明，在肺轉(zhuǎn)移模型中，抑制自噬不僅可以減少肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，而且還可以降低肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡[14]。鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療是喉癌治療中重要方式之一，化療耐藥的產(chǎn)生降低了化療療效。研究表明癌細(xì)胞通過上調(diào)保護(hù)性自噬使腫瘤對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性[15]，抑制自噬可以提高癌癥患者化療的效果。

總之，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、抗癌治療過程中，自噬起著至關(guān)重要的作用。p62是自噬重要調(diào)節(jié)因子，是解決抗癌治療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)，通過調(diào)控p62的表達(dá)為提高腫瘤治療提供了潛在治療策略。