王譽穎，韓德平 , 閆 雪 , 劉雪連，吳 棟 , 王 佳 , 馬云飛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100193；2.北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司 飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 海淀 100192)

雞白痢沙門菌是一種常見的腸道致病菌，在家禽之間廣泛傳播，嚴重影響家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對人類健康也造成一定的威脅。沙門菌感染腸上皮細胞后，促使上皮細胞及穿插的淋巴細胞分泌趨化因子，趨化因子吸引炎性細胞聚集到感染部位，導致炎性細胞因子的釋放，使炎癥進一步加重[1]。益生菌對腸道黏膜具有保護作用，研究表明，益生菌能夠有效促進消化道內(nèi)的菌群平衡，拮抗致病菌，增強機體的免疫功能，提高畜禽生產(chǎn)性能和飼料的利用率等[2-4]。本實驗室前期的研究表明[5]，飼喂干酪乳桿菌能維護斷奶仔豬腸黏膜結(jié)構(gòu)，減輕大腸桿菌的侵害。另有研究表明[6]，干酪乳桿菌能誘導腸道中T淋巴細胞的分化，調(diào)節(jié)細胞因子的表達，增強腸道黏膜免疫。雛雞的盲腸具有腸絨毛，在組織結(jié)構(gòu)上不同于其他動物。同時盲腸是大腸的起始端，在雛雞腸道免疫中起重要的作用。腸絨毛的上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量一定程度上反映腸道對抗外來刺激能力[7]。本研究采用組織學及免疫學的方法，探究經(jīng)口飼喂干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量及炎性細胞因子表達的影響，旨為干酪乳桿菌作為一種預防雛雞雞白痢的新型飼料添加劑的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及樣品采集 干酪乳桿菌LactobacilluscaseiDBN023和雞白痢沙門菌SalmonellapullorumCMCC-533分別作為益生菌和致病菌模式菌株。干酪乳桿菌由大北農(nóng)飼用微生物國家重點實驗室提供，通過發(fā)酵凍干，制成菌粉添加到基礎(chǔ)日糧中，添加劑量為108CFU/g。雞白痢沙門菌CMCC-533由中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心提供，在第7日齡，需要攻毒的4個組口腔灌服半致死劑量雞白痢沙門菌，空白對照組和干酪乳桿菌組口服等量PBS 作為對照。選用450只1日齡SPF 健康雛雞，隨機分為6個處理組，每個處理5個重復，每個重復15只雞，分組如下：(1)空白對照A組：飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，不進行沙門菌感染；(2)沙 門菌攻毒B組：飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，進行沙門菌感染；(3)干酪乳桿菌C組：飼喂添加干酪乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g， 不進行沙門菌感染；(4)預防D組：前期飼喂添加植物乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g，進行沙門菌感染后，飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧；(5)治療E組：前期飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，進行沙門菌感染后，飼喂添加干酪乳桿菌的基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g；(6)預防治療F組：全期飼喂添加干酪乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量均為108CFU/g，并進行沙門菌感染。在28日齡時，每組每個重復隨機選取1只雛雞，頸動脈放血致死，剖開腹腔，取2段盲腸中段2 cm 腸段，用PBS沖洗以除去腸內(nèi)容物。一段在4%多聚甲醛中固定48 h，期間換1次固定液，用于蘇木精和伊紅(H.E.)染色；另一段放入裝有RNA store[DP408，天根生化科技(北京)有限公司]液體的小管里，置于-80 ℃冰箱保存，用于進一步分析細胞因子水平。

1.2 石蠟切片的制作及H.E.染色 將固定好的組織塊進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，準備4 μm厚的連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染色15 min，1%鹽酸-酒精溶液分色后，自來水藍化15 min； 常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Nikon Ni-U顯微鏡觀察。

1.3 腸道細胞因子水平的測定 取出置于-80 ℃冰箱保存的盲腸腸段，根據(jù)制造商的協(xié)議使用雞ELISA測定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)測定盲腸中的細胞因子水平。腸道中的細胞因子分別使用雞白細胞介素-4(IL-4)ELISA檢測試劑盒、雞白細胞介素-10(IL-10)ELISA檢測試劑盒、雞白細胞介素-17(IL-17)ELISA檢測試劑盒和雞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA測定試劑盒進行測定。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 利用IPP 6.0軟件統(tǒng)計每100個柱狀上皮細胞間的淋巴細胞數(shù)量。采用SPSS 17.0 One-Way ANOVA模板進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)”表示。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理后雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的變化 空白對照組的絨毛結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛黏膜固有層無炎性細胞和紅細胞浸潤(見封二彩版圖1A)；沙門菌攻毒組絨毛黏膜固有層有炎性細胞和紅細胞浸潤(見封二彩版圖1B)；其他組與空白對照組相似，腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，無明顯病理變化(見封二彩版圖1C，1D，1E，1F)。表明干酪乳桿菌可以維持盲腸正常的黏膜組織形態(tài)，緩解沙門菌的損害作用。

圖1 干酪乳桿菌對雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的影響Fig. 1 Effect of Lactobacillus casei on the morphology of chickling caecum mucosaA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組； D：預防組； E：治療組； F：預防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group;D:Prevention group; E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

2.2 不同處理后雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量顯著降低了30.31%(P=0.020)；與沙門菌攻毒組相比，預防治療組盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量增加了42.11%，差異顯著(P=0.027)。表明干酪乳桿菌可以增加盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量，增強腸道免疫功能。見圖2。

圖2 干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的影響Fig. 2 Effects of Lactobacillus casei on the number of lymphocytes in the cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組；D：預防組； E：治療組； F：預防治療組注：柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05);下圖同A:Blank control group; B:Salmonella challenge group;C:Lactobacillus casei group; D:Prevention group;E:Treatment group; F:Preventive plus treatment groupNote: Different letters on the column indicate significant differences between groups (P<0.05).The same as below

2.3 不同處理后雛雞盲腸抗炎性因子表達量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組的表達量下降了42.39%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預防組、治療組、預防治療組IL-4的表達量分別增加了33.11%、57.23%、64.35%，差異極顯著(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。與空白對照組相比，沙門氏菌攻毒組IL-10的表達量下降了44.67%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預防組、治療組、預防治療組IL-10的表達量分別增加了49.09%、85.02%、102.7%，差異極顯著(P=0.001，P=0.000，P=0.000)。表明干酪乳桿菌促進抗炎性因子的表達，增強腸道的抗炎能力。見圖3。

圖3 干酪乳桿菌對雛雞盲腸抗炎性因子表達的影響Fig. 3 Effects of Lactobacillus casei on the expression of anti-inflammatory factors in the cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組； D：預防組； E：治療組； F：預防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group;D:Prevention group; E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

2.4 不同處理后雛雞盲腸致炎性因子表達量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組IL-17的表達量增加了53.47%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預防組、治療組、預防治療組IL-17的表達量分別下降了18.71%、25.21%、43.57%，差異極顯著(P=0.001，P=0.002，P=0.000)。與空白對照組相比，沙門菌攻毒組TNF-α的表達量分別增加了67.29%，差異極顯著(P=0.000);與沙門菌攻毒組相比，預防組、治療組、預防治療組TNF-α的表達量分別下降了23,34%、22.17%、40.29%，差異極顯著(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。表明干酪乳桿菌抑制致炎性因子的表達，避免過度的炎癥反應。見圖4。

3 討論

3.1 干酪乳桿菌對雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的影響 腸黏膜屏障能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細菌和毒素的侵入，完整的腸黏膜上皮細胞是腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，腸黏膜上皮細胞的受損可能導致腸道黏膜屏障的損害[8]。肉雞補充益生菌，其絨毛高度增加，促進腸上皮細胞的更新[9]。本研究結(jié)果顯示，在沙門菌攻毒后腸上皮細胞排列紊亂、脫落，而飼喂干酪乳桿菌進行預防或治療的雛雞盲腸上皮細胞可以保持相對完整，說明干酪乳桿菌能有效抵御沙門菌對腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)的破壞，維護腸道黏膜屏障的完整性。

3.2 干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的影響 腸上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)是大量且多樣化的淋巴樣細胞群，其位于形成腸黏膜屏障的腸上皮細胞之間。IEL子集彼此之間以及與上皮外的免疫細胞相互通信，可促進其屏障功能[10]。腸絨毛的上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量在一定程度上反映腸道對抗外來刺激能力[7]。本研究結(jié)果中，沙門菌攻毒組上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量顯著下降，顯示腸道對抗外來刺激能力下降，免疫屏障受到破壞。有研究表明，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能增加腸上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量，改善LPS誘導的大鼠損傷，維護腸道功能[11]。本研究結(jié)果顯示，飼喂干酪乳桿菌預防治療組IEL數(shù)量顯著高于沙門菌攻毒組。說明飼喂干酪乳桿菌能提高腸道的免疫功能，抵抗致病菌的入侵。

圖4 干酪乳桿菌對雛雞盲腸致炎性因子表達的影響Fig. 4 Effects of Lactobacillus casei on the expression of inflammatory factors in cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組；C：干酪乳桿菌組； D：預防組； E：治療組；F：預防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group; D:Prevention group;E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

3.3 干酪乳桿菌對雛雞盲腸細胞因子的影響 IEL在免疫監(jiān)視和細胞介導的黏膜免疫中具有重要的作用。病原菌侵入機體后，IEL可產(chǎn)生與多種細胞因子，調(diào)節(jié)其他淋巴細胞和上皮細胞的功能。根據(jù)細胞因子在炎性反應中的作用不同分為2類：致炎細胞因子(IL-17、TNF-α等)和抗炎細胞因子(IL-4、IL-10等)。IL-4對巨噬細胞所產(chǎn)生的IL-1、TNF和PGE2起負調(diào)節(jié)作用，提示它具有抗炎作用。IL-10是主要由單核巨噬細胞、T淋巴細胞分泌的一種抑制免疫的細胞因子，它的主要作用是抑制炎癥反應，防止炎癥擴大化，在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)和抗感染中起關(guān)鍵作用[12-13]。IL-17由Th17細胞產(chǎn)生，它可促進中性粒細胞的發(fā)育成熟，并且刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞及纖維母細胞表面細胞間粘附分子-1的表達。IL-17可刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2等，誘導炎癥反應，IL-17在炎癥發(fā)生過程中起重要的調(diào)控作用[14]。TNF-α是由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的細胞因子，它可使中性粒細胞在炎癥局部聚集并使其活化，能夠促進單核細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生細胞因子，改變腸上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能，擴大炎癥連鎖反應，造成腸道組織的損害[15]。益生菌能夠通過調(diào)節(jié)機體腸道致炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡，維持免疫穩(wěn)態(tài)，在提高機體免疫的同時，避免炎癥的發(fā)生[16]。有研究表明，干酪乳桿菌能夠誘導小鼠腸道中T淋巴細胞的分化，調(diào)節(jié)細胞因子的表達[6]。本研究表明，沙門菌攻毒后，致炎細胞因子IL-17、TNF-α的含量顯著增加，抗炎細胞因子IL-4、IL-10的含量顯著降低，顯示動物機體誘發(fā)炎癥反應。使用干酪乳桿菌預防或治療后抗炎因子IL-4、IL-10的含量顯著增加，致炎細胞因子IL-17、TNF-α含量顯著下降，說明干酪乳桿菌通過調(diào)節(jié)致炎細胞因子和抗炎細胞因子含量的變化來減輕沙門菌誘導的炎癥反應。此外，本研究結(jié)果顯示，干酪乳桿菌組致炎細胞因子IL-17、TNF-α的含量顯著高于空白對照組。根據(jù)已有研究結(jié)果IL-17A抑制或IL-17 RA型受體抑制可誘導或加重小鼠結(jié)腸炎模型[17]，以及乳桿菌誘導早期使細胞因子TNF-α表達上調(diào)[18]，推測IL-17、TNF-α除對機體有促進炎癥反應外，可能存在其他影響，還需進一步探討。

綜上所述，飼喂干酪乳桿菌進行預防治療能維護雛雞盲腸上皮細胞的完整性，保護腸道黏膜屏障，降低沙門菌的侵害。同時飼喂干酪乳桿菌能夠一定程度上提高雛雞腸道上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)炎性細胞因子的平衡，增強腸道的免疫能力，緩解沙門菌誘導的炎癥反應。本研究為干酪乳桿菌應用于生產(chǎn)實踐提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。