章能勝，陳曉玲，胡豐林

(1.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院 醫(yī)學系，安徽 池州 247099；2.安徽農(nóng)業(yè)大學 安徽省微生物防治重點實驗室，安徽 合肥 230036)

蟲生真菌古尼擬青霉(PaecilomycesgunnniLiang)為古尼蟲草[Cordyceps gunnii (Berk.)Berk.]的無性型[1]，其藥用價值與古尼蟲草相當[2]。近年來，古尼擬青霉活性研究主要集中在抗氧化[3]、鎮(zhèn)靜[4-5]、鎮(zhèn)痛[6]和抗腫瘤[7]等。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)古尼擬青霉有較強的清除自由基活性。本研究在前期研究基礎上，利用響應面分析法(Response Surface Methodology，RSM )對古尼擬青霉中清除自由基活性組分超聲波提取工藝進行優(yōu)化，旨在為深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株古尼擬青霉(PaecilomycesgunnniLiang)，由安徽農(nóng)業(yè)大學微生物防治省重點實驗室提供，菌株號為RCEF4117。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40，蛋白胨10，酵母浸粉10，瓊脂20，配置好后用蒸餾水定容。

1.1.3 主要儀器與試劑

Spectra Max M2型酶標儀，美國Molecular device公司；KH5200型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司；LRT-250G型光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；化學純葡萄糖，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；蛋白胨，天津大茂化學試劑廠；酵母浸出粉，英國OXOID公司；分析級甲醇，上海建信化工有限公司；分析純?nèi)燃淄?，無錫市亞盛化工有限公司；分析純乙酸乙酯，安徽淮南化學試劑廠，分析純石油醚，上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

將滅菌培養(yǎng)基倒好培養(yǎng)皿后，將剪好的滅菌玻璃紙鋪于培養(yǎng)基上，接種1 mL種子液于玻璃紙表面，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天，刮取菌絲冷凍干燥備用。

1.2.2 清除自由基活性測定

本研究采用自由基為二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)，具體測定方法參考胡豐林的酶標儀實驗法(DPPH-Microplate)[8]。

1.2.3 最佳浸提溶劑的選擇

準確稱取6份樣品，按照料液比為1: 20分別加入水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等六種溶劑，室溫下利用超聲波浸提30 min，離心取上清液，經(jīng)真空濃縮凍干后進行活性測定。

1.2.4 單因素實驗

以自由基清除率為考察指標，甲醇作為浸提溶劑，按照上述提取過程，分別對提取溫度、提取時間和料液比進行單因素實驗。提取溫度(℃)設5個水平：20、40、60 、80 、100；提取時間(min)設置4個水平：10、30 、60 、120；料液比(mg/μL)設置4個水平：1:10、1:20、1:30、1:40。

1.2.5 響應面實驗

在單因素實驗基礎上，利用design expert軟件的Box-Behnken設計三因素三水平的響應面實驗(見表1)，對超聲波提取工藝進一步優(yōu)化，其中響應值為自由基清除率，自變量為影響較大的3個因子即提取溫度、提取時間和料液比。

表1 響應面分析因子和水平表

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3 次，實驗結(jié)果用平均值±標準差表示，用SPSS 24.0和Design-Expert 8.06 對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 最佳浸提劑的選擇

本研究選取水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚等六種極性不同的溶劑提取古尼擬青霉菌絲中具有清除自由基的活性的物質(zhì)。從圖1可看到，供試樣品的甲醇提取物活性最強，其次是正丁醇、水，石油醚提取物的活性最弱，表明供試樣品的活性組分為中等偏上極性的化合物，甲醇為最佳提取溶劑。

圖1 提取溶劑對自由基清除率的影響

2.1.2 提取溫度對自由基清除率的影響

由圖2可知，隨著提取溫度的升高，供試樣品的清除自由基活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度達到40℃時，自由基清除率最高，隨著溫度繼續(xù)升高，自由基清除率反而下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為溫度較低時，溫度升高有利于樣品中清除自由基活性組分的提取，溫度過高時，高溫會破壞活性組分的結(jié)構(gòu)，導致活性下降。

圖2 提取溫度對自由基清除率的影響

2.1.3 提取時間對自由基清除率的影響

由圖3可知，提取時間為30 min時，供試樣品中的清除自由基活性組分浸出率最高。隨著提取時間的延長，活性組分浸出率沒有上升，反而呈現(xiàn)少許下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于提取時間過長，會導致過多的其他組分被浸提出，影響了供試樣品的清除自由基的活性。

圖3 提取時間對自由基清除率的影響

2.1.4 料液比對自由基清除率的影響

由圖4可知，隨著料液比增加，供試樣品中的清除自由基活性組分浸出率呈現(xiàn)上升趨勢，當料液比1:30 mg/μL時達到最大值，繼續(xù)增大料液比活性組分的浸出率沒有持續(xù)上升。這可能是因為料液比較小時供試樣品中活性組分不能完全溶解于提取液中，若增加溶劑的比例，活性組分得率會增加；當料液比過大時供試樣品中活性組分已完全被浸提出，此時再增加溶劑的比例已無意義。

圖4 料液比對自由基清除率的影響

2.2 響應面分析法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析

在單因素實驗基礎上，設計響應面實驗優(yōu)化古尼擬青霉中清除自由基活性成分提取工藝，結(jié)果見表2。運用軟件中Box-Behnken進行擬合，得到響應面的回歸模型的方程為：Y= 96.52 - 0.18 A + 0.029 B - 0.085 C- 0.36 A B+ 0.30 A C + 0.048 BC- 0.40 A2- 1.58 B2- 1.87 C2。

表2 響應面實驗設計方案及實驗結(jié)果

由表3可知，二次項B2(提取時間)、C2(料液比)對古尼擬青霉清除自由基活性有極顯著的影響(P<0.01)，二次項A2(提取溫度)、交互項AB、AC的影響顯著(P<0.05)，其余項均不顯著。模型P<0.0001，可見本實驗選用的模型是極顯著。模型的失擬相(Lack of Fit)P>0.05，表明正常誤差在回歸方程與實際擬合所占比例較小，表明方程擬合性強，模型是可行的。相關系數(shù)R=0.9854，表明模型推算值與實際值接近，模型的擬合度高，實驗誤差小，可見該模型在統(tǒng)計學上有現(xiàn)實指導意義。

表3 回歸模型顯著性結(jié)果

2.2.2 響應面圖分析

由響應面分析圖(圖5)形狀(開口向下且等高線最小橢圓的中心在-1～1范圍內(nèi))可知，響應面存在最大值。又因為溫度和時間、溫度和料液比的等高線為橢圓形狀，表明提取溫度、提取時間和提取溫度、料液比的交互效應均顯著，而時間和料液比的等高線為近圓形，表明提取時間和料液比交互效應不顯著，與回歸模型顯著性結(jié)果相吻合。對回歸方程分析得最佳提取工藝為：提取溫度37℃，提取時間34 min，料液比1:30，理論最佳自由基清除率為96.61%。

圖5 響應面分析圖

2.2.3 驗證試驗

為了驗證響應面法的可行性，采用上述最佳提取工藝進行了3次平行實驗，得到實際自由基清除率平均為96.58%，與理論值接近，進一步表明模型的科學性。因此，響應面法優(yōu)化古尼擬青霉中清除自由基活性成分提取工藝是可行的。

3 討論與結(jié)論

目前，響應面法由于提供了響應面區(qū)域內(nèi)的必要信息，較大程度上擴展了有限的資源利用效率，能夠優(yōu)化加工條件，降低生產(chǎn)成本，廣泛運用于生物、化工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領域。[9]本研究是在單因素實驗的基礎上，將響應面法應用于優(yōu)化古尼擬青霉中清除自由基活性成分的提取。結(jié)果表明最佳提取工藝條件為：提取溶劑為甲醇，提取溫度為37℃，提取時間為34 min，料液比為1:30。在最佳工藝條件下，實際自由基清除率為96.58%，與預測值非常接近，表明模型的擬合度較好，優(yōu)化后提取工藝可靠、準確。