才德吉 措毛吉 萬瑪南杰

青海紅十字醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2產(chǎn)科，3小兒外科（西寧810000）

非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）發(fā)生率約占肺癌80%以上，5年生存率不足20%［1-2］，由于目前對(duì)肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，晚期肺癌尚無有效的化療藥物［3?4］，世界范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤第一位。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白TIPE（tumor necrosis factor?α?induced protein 8，TNFAIP8）基因家族是新發(fā)現(xiàn)的一類癌基因家族［5］，在胰腺癌、胃癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，近年來研究表明TIPE 可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6-7］。雖然有研究報(bào)道TIPE與肺癌細(xì)胞遷移、化療敏感性有關(guān)，但迄今為止，TIPE在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明晰。有研究發(fā)現(xiàn)TIPE 可能通過Wnt/β?catenin 信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)特性，Wnt 信號(hào)通路是傳遞細(xì)胞生長(zhǎng)刺激信號(hào)的一類重要通路，其異?；罨c腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)通過沉默非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞中TIPE 基因的表達(dá)，檢測(cè)β?catenin在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，為明確TIPE 基因、Wnt/β?catenin 信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌中的機(jī)制研究初步奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清（美國(guó)Sigma 公司）；TIPE、β?catenin 抗體（美國(guó)Abcam 公司）、流式凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RT?PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）；CCK8 試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；GFP 熒標(biāo)記的shRNA?TIPE 慢病毒載體、TIPE、β?catenin、β?actin 引物序列由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建制備（表1）。

表1 TIPE、β?catenin、β?actin 引物序列Tab.1 Primer sequences of TIPE，β?catenin and β?actin

1.2 方法

1.2.1 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 培養(yǎng)及shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞，使用感染液將細(xì)胞制成5×105個(gè)/mL 懸液種植到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明加入適量的病毒液，培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞3 000 r/min離心1 min，去掉上清液，更換為DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達(dá)情況，感染效率高于90%后細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定感染shRNA?TIPE 慢病毒的細(xì)胞記為shRNA?TIPE，穩(wěn)定感染shRNA 陰性對(duì)照的慢病毒記為shRNA?NC，無質(zhì)粒載體的細(xì)胞為空白對(duì)照。

1.2.2 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549內(nèi)TIPE、β?catenin的表達(dá)取上述3 組細(xì)胞，加入TRIZOL 細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總內(nèi)RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β?actin 為內(nèi)參，TIPE、β?catenin 引物為模板檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平，反轉(zhuǎn)錄條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸6 min。根據(jù)公式Folds=2?△△Ct計(jì)算TIPE、β?catenin 基因的相對(duì)表達(dá)量，其中△△Ct=（Ct檢測(cè)基因?Ctβ?actin）實(shí)驗(yàn)組?（Ct檢測(cè)基因?Ctβ?actin）對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。取3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，加入RIPA 蛋白裂解液抽提總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，每孔取50 μg 總蛋白，加上樣緩沖液100 ℃變性5 min，10%SDS?PAGE 電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)移至NC 膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，洗膜，按順序加入一抗、二抗，ECL 顯色，Bandscan5.0 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 沉默TIPE基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖、凋亡的影響CCK8 實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期慢病毒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，0.25%胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，1 × 104個(gè)/孔濃度接種于96 孔板，培養(yǎng)箱中孵育0、24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)加入10 μL CCK8 試劑，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在波長(zhǎng)490 nm 處吸光度（OD）值，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率（%）=（1?實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%，培養(yǎng)板四周設(shè)置空白對(duì)照孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，1 000 個(gè)/孔接種于6 孔板，待細(xì)胞形成肉眼可見細(xì)胞克隆后加入0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取上述轉(zhuǎn)染48 h 后A549 細(xì)胞，加入500 μL 的An?nexin V 緩沖液重懸細(xì)胞，Annexin V?FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，兩組以上間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染后TIPE、β?catenin表達(dá)變化shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 后，TIPE mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（0.33 ±0.07），低于陰性對(duì)照組（1.00±0.13）和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=103.0，P<0.000 1）；shRNA?TIPE 轉(zhuǎn)染后，TIPE 蛋白相對(duì)表達(dá)量減少至（0.23 ±0.06），低于陰性對(duì)照組（0.75 ± 0.22）和空白對(duì)照組（0.76±0.28）（F=10.57，P=0.002 3）（圖1）。shR?NA?TIPE 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后，β?catenin mRNA、蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（圖2），表明shRNA?TIPE 慢病毒感染可成功沉默TIPE 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)下調(diào)A549 細(xì)胞內(nèi)β?catenin mRNA 和蛋白水平。

2.2 shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡變化細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示TIPE 基因沉默后A549 細(xì)胞克隆形成能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 17.48，P= 0.000 3），表明TIPE 基因能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 增殖。采用生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默TIPE 基因后細(xì)胞增殖情況，沉默TIPE 基因后A549 細(xì)胞增殖能力下降（圖3）。

圖1 shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染后A549 細(xì)胞內(nèi)TIPE mRNA、蛋白表達(dá)變化Fig.1 The expression of TIPE mRNA and protein in A549 cells transfected with shRNA TIPE lentivirus

圖2 shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染后A549 細(xì)胞內(nèi)β?catenin mRNA、蛋白表達(dá)變化Fig.2 The expression of β?catenin mRNA and protein in A549 cells transfected with shRNA TIPE lentivirus

2.3 shRNA?TIPE慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡變化為進(jìn)一步確認(rèn)TIPE 在A549 細(xì)胞中的致癌作用，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。見圖4，shRNA?TIPE慢病毒轉(zhuǎn)染后，A549細(xì)胞凋亡率（18.4±4.5）%明顯高于陰性對(duì)照（12.7 ± 3.6）%和空白對(duì)照組（11.5 ±3.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.484 4，P=0.035 1），表明沉默TIPE 基因后可促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡。

3 討論

NSCLC 包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌，占肺癌80%以上，是癌癥主要死亡原因之一［9］。據(jù)報(bào)道中國(guó)肺癌患者中男性的發(fā)病率接近70%，女性發(fā)病率超過30%，世界范圍內(nèi)每年有180 萬例肺癌新發(fā)病例和160 萬例肺癌患者死亡［10］，因此闡明肺癌發(fā)病機(jī)制刻不容緩。手術(shù)、放化療等手段是目前NSCLC 患者的主要治療方案，但局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC患者最終死亡的主要原因［11-12］，因此闡明肺癌發(fā)病過程中關(guān)鍵基因可能為肺癌臨床診治提供新思路。

圖3 shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖變化Fig.3 The change of cell proliferation after shRNA TIPE lentivirus transfection

TIPE 家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的癌基因家族，目前發(fā)現(xiàn)TIPE 家族成員包括TIPE、TIPE1、TIPE2、TIPE3，TIPE 是首先被發(fā)現(xiàn)的家族成員，參與細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程［13］。有研究發(fā)現(xiàn)TIPE 在多種實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，TIPE 的表達(dá)水平與腫瘤的TNM 分期相關(guān)［14-15］。TIPE 家族成員具有高度同源性的序列，其核酸序列的氨基末端包含一個(gè)死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death effector domain，DED），DED 通過Fas 結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［16-17］。有學(xué)者通過構(gòu)建TIPE 過表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞Hela 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的Hela 細(xì)胞的亞G1 期細(xì)胞數(shù)量增加，轉(zhuǎn)染的Hela 細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TIPE 的DED 能負(fù)向抑制Caspase 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［18-19］。本研究通過構(gòu)建shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 后，A549 細(xì)胞克隆形成能力、增殖能力下降，A549細(xì)胞凋亡率（18.4±4.5）%明顯高于陰性對(duì)照（12.7 ± 3.6）%和空白對(duì)照組（11.5 ±3.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.484 4，P=0.035 1），表明TIPE 基因具有促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用，然而其機(jī)制原因尚未完全明確。既往研究證實(shí)β?catenin 信號(hào)通路的異?；罨c肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Wnt/β?catenin 通路是Wnt 信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)中傳遞的經(jīng)典途徑，β?catenin 更是該信號(hào)調(diào)控通路中的核心，其表達(dá)量或活性改變將直接影響Wnt/β?catenin 信號(hào)通路的功能［20］。研究證實(shí)NSCLC 組織、細(xì)胞中Wnt/β?catenin 信號(hào)呈異?；罨癄顟B(tài)，其異?；罨癄顟B(tài)受c?Myc、p53 等癌基因表達(dá)調(diào)控［21］，且異常活化的β?catenin 使肺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡能力［22］。本研究發(fā)現(xiàn)shRNA?TIPE 慢病毒轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 后，TIPE 和β?catenin mRNA、蛋白表達(dá)均下降，表明shRNA?TIPE 慢病毒感染可成功沉默TIPE 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)下調(diào)A549 細(xì)胞內(nèi)β?catenin mRNA 和蛋白表達(dá)水平。本研究初步探討TIPE 下調(diào)Wnt/β?catenin 信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 增殖、凋亡的影響，推測(cè)TIPE 可能通過Wnt/β?catenin 參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，TIPE可能通過激活Wnt/β?catenin信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖，抑制凋亡，通過構(gòu)建shRNA?TIPE 慢病毒進(jìn)一步明確了TIPE、β?catenin 在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制，為后續(xù)NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的研究方向。