張茂華 羅金鍵 王康康 汪秀梅 吳慧麗

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科（鄭州450007）

肝硬化是臨床常見慢性肝病，是多種原因引起的肝臟進(jìn)行性、彌漫性、纖維性病變，我國肝硬化病因以乙型病毒性肝炎為主，是乙型肝炎病毒（HBV）持續(xù)感染，導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和纖維化的結(jié)果［1］。臨床常采用外科手術(shù)、抗病毒等手段治療乙肝肝硬化，但遠(yuǎn)期生存率仍較低［2］。研究［3］表明，乙肝肝硬化主要是由病毒誘發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng)所致，HBV感染期間，T淋巴細(xì)胞可通過腫瘤壞死因子?α/核因子?κB（TNF?α/NF?κB）信號通路被激活，起到抑制或清除病毒的作用。CD40 及其配體（CD40L）分別表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞和活化T 細(xì)胞表面，兩者相互作用為T 細(xì)胞活化提供必要的協(xié)同刺激信號，促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)［4］。近年來研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，CD40 基因位點(diǎn)多態(tài)性與甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等自身免疫性疾病發(fā)病關(guān)系密切，但關(guān)于CD40 遺傳位點(diǎn)多態(tài)性與乙肝肝硬化發(fā)病及預(yù)后報道尚少。為明確CD40基因位點(diǎn)多態(tài)性在乙肝肝硬化中的作用，本研究選取480例乙肝肝硬化患者，分析CD40基因多態(tài)性與遺傳易感性和預(yù)后生存的關(guān)系，為乙肝肝硬化的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年2月至2018年1月本院收治的480 例乙肝肝硬化患者，其中男336 例，女144例；年齡43 ～73歲，平均（54.20±9.44）歲，乙肝病毒感染病程8 ～33年，平均（15.51 ± 6.02）年；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?6 例，糖尿病35 例，高脂血癥42 例；所有患者均接受保肝、抗纖維化、糾正肝功能等對癥內(nèi)科綜合治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)腹部影像學(xué)或肝臟病理學(xué)檢查證實(shí)；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；（3）乙肝表面抗原（HBsAg）陽性時間6 個月以上，且PCR 法檢測兩次HBV DNA 含量> 1 000 copies/mL；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并艾滋病病毒感染、其他類型肝炎病毒感染者；（2）合并原發(fā)性肝癌、肝衰竭或其他病因所致的肝硬化者；（3）合并自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化、甲狀腺功能亢進(jìn)等。

選取門診收治的乙肝肝硬化患者480 例為乙肝組，其中男359 例，女121 例；年齡40 ～74 歲，平均（55.26 ± 9.13）歲，乙肝病毒感染病程8 ～25年，平均（11.63 ± 6.48）年；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?2 例，糖尿病31 例，高脂血癥40 例。

此外，選取同期體檢中心收入的健康受試者480 例為健康組，其中男342 例，女138 例；年齡45 ～75 歲，平均（55.87±9.12）歲，既往接種乙肝疫苗或體內(nèi)有乙肝病毒相關(guān)抗體。所有受試者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 基因多態(tài)性檢測采集所有受試者外周血2 mL，靜置分層，加入抗凝管，細(xì)胞裂解液孵育后，2 500 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），取沉淀，采用酚氯仿法抽提DNA，然后采用聚合酶鏈反應(yīng)?限制性片段長度多態(tài)性（PCR?RFLP）法檢測目的基因多態(tài)性：采用PCR 擴(kuò)增試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書擴(kuò)增目的片段，引物序列CD40?rs1883832：F：5′?ATGCTGATGCTGGTAGCA?3′，R：5′?CCATGCTGATGCTGATGT?3′；CD40?rs4810485：F：5′?ACGTGATGCTGGCTACGAC?3′，R：5′?CGAT?GCTGATGCTGATGCA?3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；（95 ℃變性60 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s）40 個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min，獲得PCR 產(chǎn)物。設(shè)定RELP 反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物5.0 μL，Buffer 緩沖液1.0 μL，限制性內(nèi)切酶1.0 μL（NCOⅠ、MSPL），ddH2O 8.0 μL，37 ℃水浴酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行30 g瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照鑒定，采用雙盲法進(jìn)行基因型判讀（CD40?rs1883832：長度為332 bp條帶為CC 基因型，長度為332、272、105 bp 條帶為CT 基因型，長度227、105 bp 條帶為TT 基因型；CD40?rs4810485：長度為435 bp 條帶為CC 基因型，長度為435、272、163 bp 條帶為CG 基因型，長度272、163 bp 條帶為GG 基因型），由2 人分別進(jìn)行判讀，對結(jié)果不一致的樣本重新檢測，基因分型成功率100%。

1.3 臨床資料收集及隨訪收集受試者臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI=體質(zhì)量/升高2）、吸煙史（吸煙> 5 支/d，煙齡> 5年）、飲酒史（飲酒量> 40 g/d，酒齡> 5年）、乙肝病毒感染病程（>10年，≤10年）、有無抗病毒治療、肝功能Child?Turcotte?Pugh（CTP）分級、肝硬化分期［代償期（Child?Pugh A 級），失代償期（Child?Pugh BC級）］、并發(fā)癥（門靜脈高壓、上消化道出血、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、原發(fā)性肝癌等）、CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因型及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：HBV DNA 含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平、凝血酶原活動度。以查詢病例檔案或電話方式隨訪，明確乙肝肝硬化患者生存情況，每3 個月至少隨訪1 次，隨訪時間為2015年2月至2020年1月，終點(diǎn)事件為乙肝肝硬化導(dǎo)致的死亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SHEsis軟件對健康組CD40?rs1883832、CD40?rs4810485位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率進(jìn)行Hardy?Weinberg 平衡分析。采用SPSS 22.0 分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，兩樣本計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級計數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan?Meier 法分析不同基因型患者預(yù)后生存情況，并進(jìn)行Log?rank 檢驗(yàn)，并采用Cox 回歸分析模型分析CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因型與乙肝肝硬化預(yù)后生存情況。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料比較病例組、乙肝組及健康組性別構(gòu)成、年齡、BMI、吸煙史患者占比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）；病例組飲酒史患者占比高于乙肝組和健康組，乙肝組飲酒史患者占比、乙肝病毒感染病程高于健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 三組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between two groups例（%）

2.2 Hardy?Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)經(jīng)Hardy?Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，健康組CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 位點(diǎn)基因型頻率實(shí)際值與理論值見比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），符合Hardy?Weinberg 遺傳平衡規(guī)律，本研究所選樣本具有群體代表性。

2.3 三組CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因多態(tài)性比較健康組、乙肝組和病例組CD40?rs1883832 基因型等級分布及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），且病例組CD40?rs1883832 T 等位基因頻率高于健康組和乙肝組，且乙肝組高于健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。健康組、乙肝組和病例組CD40?rs4810485基因型等級分布及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因多態(tài)性對乙肝肝硬化預(yù)后的影響以性別（女= 0，男= 1）、年齡（< 60 歲= 0，≥60 歲= 1）、飲酒史（無= 0，有= 1）、吸煙史（無= 0，有= 1）、乙肝病毒感染病程（≤10年= 0，> 10年= 1），抗病毒治療（有= 0，無= 1）、肝硬化分期（代償期= 0，失代償期=1）、并發(fā)癥（無=0，有=1）、HBV DNA 含量（< 104 copies/mL = 0，≥104 copies/mL = 1）、ALT（< 5 倍正常值= 0、≥5 倍正常值= 1）、凝血酶原活動度（> 75% = 0，≤75% = 1）、BMI（以18.5 ～23.9 kg/m2為對照進(jìn)行啞變量化）、CTP 分級（以A級為對照進(jìn)行啞變量化）為調(diào)整變量，分別以CD40?rs1883832 基因型（以CC 基因型為對照進(jìn)行啞變量化）、CD40?rs4810485 基因型（以CC 基因型為對照進(jìn)行啞變量化）為自變量分別建模進(jìn)行Cox 回歸分析。

Cox 回歸分析結(jié)果顯示，CD40?rs1883832 位點(diǎn)CT、TT 基因型是影響乙肝肝硬化預(yù)后的獨(dú)立危險因素（HR=1.682、2.588，P<0.05）。見表3。

表2 3 組CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因多態(tài)性比較Tab.2 Comparison of gene polymorphism of CD40?rs1883832 and CD40?rs4810485 in three groups

表3 Cox 回歸分析結(jié)果Tab.3 Cox regression analysis

2.5 CD40?rs1883832、CD40?rs4810485 基因多態(tài)性與乙肝肝硬化總生存關(guān)系分析病例組研究對象隨訪時間24 ～60個月，失訪45例，失訪率9.38%，2年病死率16.55%（72/145）。CD40?rs1883832 基因野生C 等位基因（CC + CT）患者327 例失訪24 例，2年死亡33 例；非攜帶C 等位基因（TT）患者153 例失訪21 例，2年死亡39 例；經(jīng)Kaplan?Meier生存曲線分析，CD40?rs1883832（CC + CT）基因型與TT 基因型患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 7.831，P= 0.008）。CD40?rs4810485 基因野生C 等位基因（CC + CG）患者375 例失訪33 例，2年死亡51 例；非攜帶C 等位基因（GG）患者105例，失訪12 例，死亡21 例；攜帶CD40?rs4810485（CC + CG）基因型與（GG）基因型患者生存曲線比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.128，P=0.301）。隨訪情況見表4，生存曲線見圖1、2。

3 討論

我國是HBV 病毒感染高度流行區(qū)，部分患者成年后可清除病毒，但仍有部分患者發(fā)展為慢性HBV 感染，最終導(dǎo)致肝硬化發(fā)生，乙肝肝硬化患者常因肝功能衰竭、出血傾向、肝癌而危及生命［8-10］。既往研究表明［11-12］，健康人血清中可溶性CD40（sCD40）表達(dá)水平較低，在HBV 相關(guān)肝病患者研究中發(fā)現(xiàn)，CD40 表達(dá)強(qiáng)度與炎癥程度正相關(guān)，高水平CD40 可增強(qiáng)T 細(xì)胞亞群分化從而增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力，但同時也導(dǎo)致肝臟免疫損害，干細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，但具體作用機(jī)制不明。研究顯示［13］，機(jī)體遺傳背景的差異很大程度上決定宿主對免疫反應(yīng)的差異，而CD40 基因多態(tài)性可增加多種自身免疫性疾病的易感性，探討CD40 基因多態(tài)性與乙肝肝硬化發(fā)病和預(yù)后的關(guān)系有重要臨床意義。

表4 不同基因型乙肝肝硬化患者隨訪情況Tab.4 Follow up of hepatitis B cirrhosis patients with different genotypes

圖1 CD40?rs1883832 不同基因型乙肝肝硬化患者生存曲線Fig.1 Survival curve of hepatitis B cirrhosis patients with different CD40?rs1883832 genotypes

圖2 CD40?rs4810485 不同基因型乙肝肝硬化患者生存曲線Fig.2 Survival curve of hepatitis B cirrhosis patients with different CD40 genotypes

CD40 及其配體分別屬于Ⅰ、Ⅱ型跨膜蛋白，是TNF?α受體及TNF?α家族成員，CD40/CD40L 作為免疫協(xié)同分子，在免疫炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用［14］。一方面，CD40/CD40L可通過促進(jìn)促炎因子分泌增強(qiáng)細(xì)胞毒T 細(xì)胞活性，促進(jìn)輔助性T細(xì)胞1（Th1）免疫炎癥反應(yīng)；另一方面可激活巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子抑制Th1 免疫炎癥反應(yīng)［15-16］。HBV 感染后臨床轉(zhuǎn)歸與宿主免疫狀況關(guān)系密切，基因多態(tài)性是決定素組對疾病易感性與抵抗力的重要因素。既往報道表明，CD40?rs1883832 基因多態(tài)性可通過影響CD40 表達(dá)水平，誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞向Th2 型細(xì)胞分化偏移，參與Graves′眼病免疫病理進(jìn)程，增強(qiáng)對疾病的易感性［17］。

目前關(guān)于CD40基因多態(tài)性與乙肝肝硬化易感性研究尚少，本研究選取CD40?rs1883832、CD40?rs4810485多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，病例組CD40?rs1883832 T 等位基因頻率高于健康組和乙肝組，3 組CD40?rs4810485 等位基因頻率無明顯差異，提示CD40?rs1883832 T 基因型攜帶者與乙肝肝硬化遺傳易感性關(guān)系密切，而乙肝組T等位基因頻率高于健康組，推測乙肝病毒感染可能會增加CD40?rs1883832 突變風(fēng)險，從而增加肝硬化發(fā)病風(fēng)險。分析可能機(jī)制為CD40?rs1883832 T 基因型攜帶者影響CD40 表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞毒T 細(xì)胞對HBV 感染的反應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)，肝臟長期免疫損害終致肝硬化發(fā)生；另一方面，非T 基因型攜帶者（CC 基因型）可能通過促進(jìn)Th1 向Th2 免疫漂移，抑制細(xì)胞毒T 細(xì)胞激活，從而是肝臟逃避免疫損害，僅表現(xiàn)為長期攜帶，肝硬化發(fā)生風(fēng)險較低［18］。

此外，本研究經(jīng)Kaplan?Meier 生存曲線分析，CD40?rs1883832 CC + CT 基因型患者與TT 基因型患者2年生存曲線比較有明顯差異，進(jìn)一步Cox 回歸分析，CT、TT 基因型是影響乙肝肝硬化預(yù)后的獨(dú)立危險因素，提示與CD40?rs1883832 CC+CT 基因型相比，TT 基因型乙肝肝硬化患者預(yù)后不良風(fēng)險更高。研究［19］證實(shí)，CD40 表達(dá)缺失可增加T 細(xì)胞自身反應(yīng)性，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病。CD40?rs1883832 TT 基因型乙肝肝硬化患者可能通過影響CD40 表達(dá)水平，使HBV 病毒持續(xù)激活抗病毒免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞持續(xù)受損，使急性失代償性肝硬化發(fā)生風(fēng)險增加，進(jìn)而導(dǎo)致預(yù)后生存期縮短。

綜上所述，CD40?rs1883832 基因多態(tài)性與乙肝肝硬化遺傳易感性及預(yù)后關(guān)系密切，且與CD40?rs1883832 CC+CT 基因型相比，TT 基因型乙肝肝硬化患者預(yù)后不良風(fēng)險更高。但乙肝肝硬化臨床結(jié)局由綜合因素共同決定，遺傳背景因素也十分復(fù)雜，常由多基因多位點(diǎn)共同參與調(diào)控，本研究初步探索CD40 基因多態(tài)性與與乙肝肝硬化遺傳易感性及預(yù)后關(guān)系，為乙肝肝硬化疾病防治提供理論基礎(chǔ)。