陳冰 陳國(guó)鑫 張治國(guó)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

水稻（Oryza sativaL.）是我國(guó)主要的糧食作物，提高水稻糧食產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)科研中最主要的目標(biāo)之一［1］。抽穗期（開(kāi)花時(shí)間）與地區(qū)適應(yīng)性以及產(chǎn)量密切相關(guān)，是受遺傳和環(huán)境影響的最大的性狀之一［2］。適度地調(diào)節(jié)水稻材料的開(kāi)花時(shí)間將有助于充分利用當(dāng)?shù)氐臏囟群凸庹諚l件，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量［3］。

水稻屬于短日照開(kāi)花植物，在長(zhǎng)期馴化過(guò)程中，逐漸從短日照向長(zhǎng)日照、低緯度向高緯度繁衍，水稻已進(jìn)化出適應(yīng)長(zhǎng)日照條件下的開(kāi)花調(diào)控途徑。水稻成花素兩個(gè)基因RFT1與Hd3a，在水稻中也是關(guān)系最近的同源基因，但是RFT1在長(zhǎng)日照下起作用，而Hd3a卻在短日照行使功能。目前，已鑒定一些長(zhǎng)日照的開(kāi)花調(diào)節(jié)因子SDG724、EHD4、DTH2等。SDG724編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)調(diào)控MADS50和RFT1位點(diǎn)的H3K36me2/3甲基化水平，影響“MADS50/MADS51-Ehd1-Hd3a/RFT1”途徑，促進(jìn)水稻開(kāi)花［4］。Ehd4基因編碼一個(gè)水稻特有的CCCH類鋅指蛋白，該基因通過(guò)誘導(dǎo)Ehd1調(diào)節(jié)成花素基因Hd3a和RFT1的表達(dá)從而控制抽穗［5］。DTH2是一個(gè)位于水稻第2染色體的在長(zhǎng)日照下促進(jìn)水稻抽穗的微效QTL，編碼一個(gè)CONSTANS類似蛋白，其表達(dá)受時(shí)鐘節(jié)律調(diào)控，DTH2 通過(guò)誘導(dǎo)成花素基因Hd3a和RFT1的表達(dá)而促進(jìn)水稻抽穗，且獨(dú)立于已知的Hd1和Ehd1起作用［6］。值得一提的是，突變體rid1在中日照、短日照和長(zhǎng)日照條件下均不開(kāi)花，始終停留在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，Rid1基因編碼Indeterminate domain（IDD）轉(zhuǎn)錄因子成員［7］。雖然鑒定了一些影響水稻長(zhǎng)日照的開(kāi)花基因如SDG724、RFT1、EHD4、DTH2，但是對(duì)挖掘水稻長(zhǎng)日照開(kāi)花基因還十分有限。

本課題組前期開(kāi)展了長(zhǎng)日照條件下光周期突變體的篩選，獲得了一批與長(zhǎng)日照相關(guān)的突變體。本研究以一份長(zhǎng)日照條件開(kāi)花延遲的突變體lfm1為材料，利用圖位克隆的方法克隆Lfm1基因，探討了Lfm1基因在生產(chǎn)應(yīng)用中可能存在的潛力，為培育適應(yīng)不同生態(tài)區(qū)域的水稻品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體lfm1材料來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)制的以日本晴為背景水稻突變體庫(kù)，突變性狀穩(wěn)定遺傳且高代純合［8］。材料種植于海南陵水和河北廊坊基地，用于統(tǒng)計(jì)材料的生育期。PCR反應(yīng)使用的聚合酶是南京諾維贊公司的2×Rapid Taq Master Mix（P222-AA）。分子標(biāo)記由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 遺傳分析與群體構(gòu)建 對(duì)突變體lfm1和野生型日本晴進(jìn)行正反交，獲得F1代種子，并統(tǒng)計(jì)F2后代生育期，明確控制突變體lfm1表型的遺傳規(guī)律。同時(shí)以突變體lfm1母本，以秈稻廣親和材料Dular為父本進(jìn)行雜交，配制基因定位群體。遺傳分析與群體構(gòu)建在海南陵水和河北廊坊實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2.2 水稻基因組DNA提取與PCR體系 日本晴、Dular、F2代群體的葉片基因組DNA提取參照改進(jìn)的CTAB法［9］。采用10 μL反應(yīng)體系：2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，模板DNA 50 ng，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物差異大小，選擇4%的瓊脂糖凝膠（170 V，15 min）或者10%的聚丙烯胺凝膠（200 V，120 min）跑膠。

1.2.3 分子標(biāo)記設(shè)計(jì)與基因定位 根據(jù)水稻秈粳亞種間基因組插入與缺失差異，在Gramene網(wǎng)站（http：//www.gramene.org）上進(jìn)行粳稻品種日本晴與秈稻品種9311基因組序列比對(duì)，尋找兩亞種間存在插入與缺失變異的片段，利用Primer3web（http：//primer3.ut.ee/）在線設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物大小在100-200 bp左右。開(kāi)發(fā)的初定Indel標(biāo)記共296對(duì)，實(shí)際可用Indel標(biāo)記157對(duì)，平均每隔2-3 M覆蓋水稻12條染色體。初定位用4個(gè)混池基因組DNA，每個(gè)混池有3個(gè)單株基因組DNA。同時(shí)提取200個(gè)F2代隱形表型單株基因組DNA用于精細(xì)定位和圖位克隆。

1.2.4 定位引物序列 設(shè)計(jì)引物，對(duì)候選區(qū)間Lfm1基因進(jìn)行定位，定位引物如表1。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)日照晚花突變體lfm1的發(fā)現(xiàn)

2015年5 月至10月在河北廊坊實(shí)驗(yàn)基地種植水稻突變體庫(kù)（光照為長(zhǎng)日照，容量10000份），在材料收獲時(shí)，發(fā)現(xiàn)一批在長(zhǎng)日照下開(kāi)花期有差異的材料。其中一個(gè)株系出現(xiàn)生育期延長(zhǎng)現(xiàn)象，為了研究方便，后續(xù)將其命名為lfm1（圖1-A-C），將突變體lfm1移栽至大棚中（防止降溫對(duì)育性影響），～250 d后突變體才能正常結(jié)實(shí)（圖1-D）。為了進(jìn)一步判斷突變體lfm1是否受短日照條件影響，我們將其種植于海南陵水基地（2015年12月-2016年4月生長(zhǎng)），在短日照條件下，突變體lfm1的花期與野生型差異不太顯著，約95 d可開(kāi)花結(jié)實(shí)（圖1-A、E）。

表1 引物序列

圖1 突變體lfm1開(kāi)花期表型鑒定

2.2 突變體lfm1遺傳分析

由于突變體lfm1（生育期超長(zhǎng)）在廊坊基地?zé)o法進(jìn)行雜交，我們?cè)诤Ｄ匣貙?duì)其進(jìn)行了雜交配組，將lfm1與日本晴進(jìn)行正反雜交，將獲取的F1代種植于廊坊基地（長(zhǎng)日照條件），F(xiàn)1代均表現(xiàn)為正常開(kāi)花表型（生育期～170 d），F(xiàn)2代出現(xiàn)晚開(kāi)花和正常開(kāi)花分離表型，對(duì)正反交植株按3∶1分離比進(jìn)行了卡平方檢測(cè)，卡平方檢測(cè)值均小于Х20.05（1）=3.84（表2）。上述F1和F2代的遺傳分析表明，控制突變體lfm1在長(zhǎng)日照下晚開(kāi)花的表型受一對(duì)單隱性核基因控制，為下一步進(jìn)行圖位克隆打下基礎(chǔ)。

表2 F2分離群體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 Lfm1基因定位

為了定位Lfm1基因，在海南陵水實(shí)驗(yàn)基地，配制突變體lfm1與秈稻材料Dular雜交組合，獲得大容量的F2代雜交種子，用于后續(xù)的定位試驗(yàn)。首先，我們開(kāi)發(fā)了一套分布在水稻12條染色體的180對(duì)具有多態(tài)性的Indel標(biāo)記，平均每隔3 M。用這套引物對(duì)Lfm1進(jìn)行初定位，發(fā)現(xiàn)該基因與標(biāo)記8-0.121（圖2-A）和標(biāo)記8-3.512（圖2-B）緊密連鎖，位于8號(hào)染色體的端粒附近（圖3-A）。進(jìn)一步選取了19個(gè)單株，初步將Lfm1定位在8號(hào)染色體0.121-3.512M之間。

2.4 Lfm1基因的克隆與突變區(qū)間分析

利用200個(gè)F2代隱形單株對(duì)Lfm1基因進(jìn)行精細(xì)定位（圖3-B），最終將Lfm1基因定位區(qū)間縮小到分子標(biāo)記8-0.269和與8-0.283之間，范圍為12 kb，其中包括3個(gè)基因（LOC_08g01410，LOC_08g01420，LOC_08g01430）（圖3-C，表2）。然后對(duì)突變體lfm1中這3個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)LOC_Os08g01420基因的第六外顯子有9 bp缺失（圖3-D）。經(jīng)NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LOC_Os08g01420基因編碼一個(gè)含有植物同源結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，是水稻開(kāi)花的關(guān)鍵促進(jìn)因子。經(jīng)檢索水稻已報(bào)道ehd3突變體，突變位點(diǎn)LOC_Os08g01420處第六外顯子缺失11 bp，其生育期比對(duì)照顯著延長(zhǎng)。突變體lfm1等位于突變體ehd3（圖3-D）［10］。長(zhǎng)日照條件下，對(duì)一些開(kāi)花基因進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，在lfm1突變體中，Ehd1、Hd3a和RFT1基因表達(dá)水平顯著下降，Ghd7轉(zhuǎn)錄水平提高，而Rid1和Hd1基因沒(méi)有變化，Ehd3可能依賴于Ehd1基因光周期遺傳途徑促進(jìn)水稻抽穗。

圖2 Lfm1基因定位連鎖分析

圖3 基因Lfm1的圖位克隆

2.5 突變體lfm1的潛在育種價(jià)值

Lfm1是一個(gè)促進(jìn)植物在長(zhǎng)日照條件下開(kāi)花的正因子，由于突變體lfm1在廊坊開(kāi)花較晚，我們嘗試其在低緯度條件（長(zhǎng)沙）進(jìn)行生長(zhǎng)，并進(jìn)行評(píng)估，在長(zhǎng)沙，lfm1的生育比對(duì)照增加了20 d（對(duì)照日本晴170 d，相對(duì)應(yīng)對(duì)照增加190 d）。因此，突變體lfm1穗粒數(shù)有顯著提高（圖4-A-B），突變體lfm1結(jié)實(shí)率和千粒重與野生相比差別不顯著（圖4-C-D）。但是顯示突變體lfm1在適應(yīng)的生態(tài)區(qū)具有巨大的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。

3 討論

開(kāi)花期是育種家和科研工作者最關(guān)注的農(nóng)藝性狀之一。合理的開(kāi)花期對(duì)品種的選育和栽培至關(guān)重要。一般，在中國(guó)北方，需要選育開(kāi)花期早的材料，而在南方，需要選育開(kāi)花期適度晚的材料。水稻開(kāi)花期受多個(gè)數(shù)量性狀基因影響，因此基因比較難以克隆，第一個(gè)控制水稻開(kāi)花期的基因Hd1就是利用重組自交系進(jìn)行克隆的［11］，也有一些利用染色體代換系進(jìn)行克隆的［12-15］。而在本研究中，利用F2代材料就對(duì)Lfm1進(jìn)行了成功克隆，有4點(diǎn)啟示：第一，對(duì)開(kāi)花期基因的克隆，需要選擇后代分離3∶1的，這樣就克服親本背景材料對(duì)開(kāi)花期基因的干擾。第二，對(duì)開(kāi)花期基因的克隆，合理的種植條件也很重要，我們選擇了群體在廊坊這個(gè)天然的長(zhǎng)日照條件下進(jìn)行生長(zhǎng)。第三，定位親本選擇很重要，雙親的生育期差距不要超過(guò)10 d。第四，開(kāi)花期材料如果差別很大，可以選擇F2代進(jìn)行定位克隆，如果差別不大，需要構(gòu)建高世代材料進(jìn)行定位。

圖4 突變體lfm1與野生型在長(zhǎng)沙（正季）的穗性狀比較

通過(guò)圖位克隆Lfm1基因發(fā)現(xiàn)，Lfm1基因編碼一個(gè)含有植物同源結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，是水稻開(kāi)花的關(guān)鍵促進(jìn)因子。利用RICEVAR2.0網(wǎng)站對(duì)Lfm1基因利用單倍型分析，發(fā)現(xiàn)在已有秈稻和粳稻資源材料中，存在多個(gè)SNP和INDEL變異，但是這些變異都發(fā)生在非編碼區(qū)（內(nèi)含子、5'-UTR、3'-UTR），表明LOC_Os08g01420是一個(gè)功能比較保守的基因，重要位點(diǎn)的突變?nèi)缭诰幋a區(qū)的突變會(huì)影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)對(duì)比突變體ehd3和突變體lfm1的表型和突變方式，突變體ehd3不僅表現(xiàn)為生育期延遲，還比較弱勢(shì)生長(zhǎng)特點(diǎn)［9］。對(duì)比突變方式，發(fā)現(xiàn)突變體ehd3是一個(gè)強(qiáng)突變體，可以用于后續(xù)的基因功能分析或作為背景材料的遺傳資源。而突變體lfm1雖然突變也發(fā)生LOC_Os08g01420的第六外顯子，其主要表型為生育期延遲，而無(wú)其它不利表型，因此突變體lfm1可能是一個(gè)LOC_Os08g01420基因的弱突變體材料。經(jīng)在長(zhǎng)沙種植，發(fā)現(xiàn)突變體lfm1的生育期比對(duì)照增加了20 d，由于生育期延遲，造成光合產(chǎn)物進(jìn)一步積累，因此，突變體lfm1穗粒數(shù)有顯著提高，這個(gè)結(jié)果暗示突變體lfm1在適應(yīng)的生態(tài)區(qū)具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。將來(lái)，由于突變體lfm1不是轉(zhuǎn)基因材料，可以將其通過(guò)回交轉(zhuǎn)育聚合到不同生育期的水稻主栽材料中，培育適合不同地域的育種新材料。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)篩選水稻突變體庫(kù)，獲得一份在長(zhǎng)日照條件下晚開(kāi)花的材料lfm1，其在短日照條件下能夠正常開(kāi)花，通過(guò)圖位克隆，發(fā)現(xiàn)在突變體lfm1中，LOC_Os08g01420基因的第六外顯子2800處缺失9個(gè)堿基，突變體lfm1等位于突變體ehd3。并發(fā)現(xiàn)在適度的光照條件下，突變體lfm1表現(xiàn)為穗粒數(shù)增多，生育期略延長(zhǎng)，可能存在潛在的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。